实验-Y-果蝇遗传标记分析-PAPDppt课件.ppt

实验实验 0Y 果蝇遗传标记分析果蝇遗传标记分析-PAPD一一、实验目的、实验目的：1.掌握掌握RAPD分析基本方法技术分析基本方法技术;2.了解分子标记的重要应用价值了解分子标记的重要应用价值.二、主要内容二、主要内容：基因基因DNA提取提取 PCR反应反应 电泳电泳 电泳图谱的观察、分析电泳图谱的观察、分析助教：助教：郑莹郑莹1 1fhfhfhfh三、实验原理三、实验原理:RAPD:建立在建立在PCR基础上的一种分子标记基础上的一种分子标记模板高温变性模板高温变性足够低的温度下（通常为足够低的温度下（通常为36）与随机引）与随机引物（一般物（一般10个个bp）退火）退火 PCR 电泳电泳如果两个退火位点足够近（如果两个退火位点足够近（200-2000bp左右）、分别位左右）、分别位于互补的于互补的DNA链上，可以通过链上，可以通过PCR扩增出扩增出DNA片段引物结合位点引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之序列的改变以及两扩增位点之间间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经电泳分离后通过目和长度的差异，经电泳分离后通过EB染色以检测染色以检测DNA片段的多态性。

片段的多态性2 2fhfhfhfh若位点若位点2处碱基发生改变，则处碱基发生改变，则 3 3fhfhfhfh四、实验材料四、实验材料四、实验材料四、实验材料-步骤步骤步骤步骤 :（1）D.Virilis-10只只 （2）黑腹果蝇）黑腹果蝇-P、P、F1、F1、F2、F2各各40只只 （3）其他材料）其他材料-0.2g1份（份（7种果蝇样品种果蝇样品+1种其他）种其他）/小组小组 （1）、（）、（2）的）的P、（、（3）由教师提）由教师提供，（供，（2）F1、F2用自己存的材料用自己存的材料已已经经制制备备匀匀浆浆液液,一一半半已已经经用用于于同同工工酶酶实实验验4 4fhfhfhfh制备制备DNA粗提液：粗提液：每份材料（普通果蝇每份材料（普通果蝇40只、大果蝇只、大果蝇10只、或其他材料只、或其他材料0.2g）+400L匀浆缓冲液匀浆匀浆缓冲液匀浆匀浆液匀浆液200L匀浆液匀浆液200L用于用于RAPD实实验提取验提取DNA（冰浴操作）（冰浴操作）液体倒入液体倒入1.5ml离心管离心管+22L SDS、2L的蛋白酶K 翻转混匀（动作要轻）55水浴 2h 存-20用于同工用于同工酶实验酶实验已完成已完成第一周第一周做到此做到此步步5 5fhfhfhfh一周后的实验课及课余时间一周后的实验课及课余时间:-20中取出的样品+RNA酶至酶至200g/mL，37 0.51h 等等V酚酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇（25241）抽提）抽提(慢慢旋转混匀，倾斜慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大使两相接触面增大)冰浴10min4 12000rpm 离心离心5min1.5ml新EP 上清（水相）至上清（水相）至等等V氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（241），轻混匀），轻混匀 冰浴冰浴10min4 12000rpm，5min1.5ml新EP 上清（水相）至上清（水相）至等等V异丙醇，轻轻混匀异丙醇，轻轻混匀 白色线白色线团状物团状物4 12000rpm，5min弃弃上上清清为省时老师代做此步为省时老师代做此步6 6fhfhfhfh70%酒精洗涤酒精洗涤 4 12000rpm，5min弃弃上上清清+100l TE 溶解溶解 室温干燥（不要太室温干燥（不要太干，否则干，否则DNA不易不易溶解）溶解）0.6%Agarose电泳检测电泳检测DNA质量质量(免免)2.RAPD反应反应1在在0.2ml PCR管中配制管中配制25l反应体系反应体系 （2次）次）随机引物随机引物 1l dNTP Mixture 2l Taq酶酶 0.2l 10PCR buffer 2.5l ddH2O up to 24l全班一人负责配齐（此全班一人负责配齐（此配方配方64，见下页），见下页）每桌一人领取每桌一人领取16份样品所需量份样品所需量平均配给两组平均配给两组各组等分各组等分8份份 分别加分别加8种样品的模板种样品的模板DNA 各各 1l7 7fhfhfhfh随机引物随机引物 64l dNTP Mixture 128l Taq酶酶 12.8l 10PCR buffer 160l ddH2O up to 1536l（即（即1.536 mL）反应体系反应体系64倍量（除模板外）：倍量（除模板外）：8 8fhfhfhfh2在在PCR热循环仪中进行如下反应：热循环仪中进行如下反应：94 200s 94 60s36 60s72 120s 40个循环个循环 72(300s-600s)尽量成批与老师约时间尽量成批与老师约时间3电泳电泳 2%琼脂糖凝胶电泳，观察比较不同品系或同一品琼脂糖凝胶电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并系亲子代间的条带的不同，并照相照相记录。

记录9 9fhfhfhfh操作分工操作分工技术问题技术问题注意事项注意事项助教指导：助教指导：实验作业（写在实验记录本上）实验作业（写在实验记录本上）：1.简述简述RAPD的实验原理、解决的问题；的实验原理、解决的问题；2.将你的实验结果画（剪贴）在记录本上，标出将你的实验结果画（剪贴）在记录本上，标出样品名称、差异条带等；你的实验结论是什么？样品名称、差异条带等；你的实验结论是什么？1010fhfhfhfh补充知识（课后阅读）：补充知识（课后阅读）：RAPDRFLPAFLPSTRSNP1111fhfhfhfhn n利用利用1010个碱基的一个或几个随机引个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增物非定点地扩增DNADNA片段，一般一个片段，一般一个引物可扩增引物可扩增6-126-12条条DNADNA片段，利用片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究基因多态性研究n nRAPDRAPD是一种能快速进行基因多态是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。

便易行RAPD1212fhfhfhfh1313fhfhfhfh1414fhfhfhfh是英文是英文Restriction FregrmeatRestriction Fregrmeat Length Po1ymor Length Po1ymor PhismPhism的缩写，意思是的缩写，意思是“限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性”RFLPRFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNADNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系生物的进化和分类关系所用的探针为来源于同种或不同种基因组所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNADNA的克隆，位的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)(Mark)，构建分子图谱。

构建分子图谱RFLP1515fhfhfhfh1616fhfhfhfh1717fhfhfhfh1818fhfhfhfh扩增片段多态性扩增片段多态性1919fhfhfhfh“AFLP”续：续：由于变异、进化，一种引物可以使某一由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的品系的DNA片段复制（扩增），而不能使另片段复制（扩增），而不能使另一品系的一品系的DNA片段复制（扩增）片段复制（扩增）电泳分离：同一引物扩增电泳分离：同一引物扩增品系品系1品系品系2引物如：引物如：EcoRI和和MseI相关相关引物引物2020fhfhfhfh2121fhfhfhfh短串联重复序列短串联重复序列STRs (short tendem repeats,mini-satellites)STR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是基本单位是1bp-8bp的的串联重复，串联重复，重复次数重复次数 n=15-60，已知，已知8000多个，多个，主要形式为：主要形式为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以其中以(CA)n，(GT)n 为多见1992年，年，Welssenbanch等以等以STR为标记的为标记的第二代连锁图取代了第二代连锁图取代了RFLP连锁图连锁图。

2222fhfhfhfh可变数目可变数目串联重复序列串联重复序列VNTRs(variable number tandem repeats)每个每个 VNTR 都含有都含有10-15 bp核心序列，核心序列，VNTR与与STR比较类似，但是重复顺序更长；比较类似，但是重复顺序更长；多态性及分布方面不如多态性及分布方面不如STR，因而，因而VNTR作作为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用，为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用，但是，但是，VNTR曾经对曾经对STR的基因定位运用起到的基因定位运用起到推动作用推动作用2323fhfhfhfh定义：不同个体间，基因组定义：不同个体间，基因组DNA某部位的某部位的 单核苷酸的变异单核苷酸的变异1996年，年，Lander报道了用单核苷酸多态性报道了用单核苷酸多态性标记（标记（single nucleotid polymorphism SNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记可通过杂交、序列分析、电泳等检测可通过杂交、序列分析、电泳等检测单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）2424fhfhfhfh1，The most abundant DNA marker present in the human genome，about 90%of sequences variants in human are SNP.There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs.2，A few hundred thousand are currently identified,but 17 million of SNPs out of 3 billion are estimated.3,SNPs in coding regions of genes have been termed cSNPs,about 500,000 of cSNPs and an average of about 6 per gene.Frequency of SNP in Human Genome2525fhfhfhfh1,Neutral alteration:a base substitution with no effect on the amino acid residue encoded.2,Conservative change:a base substitution that results in an altered amino acid,but has minimal effect on protein structure or function.3,Non-conservative alteration:leading 。