生物样品的处理方法课件.ppt

第五章第五章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证第五章 药物定量分析与分析方法验证&第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法&第二节第二节  定量分析方法的特点定量分析方法的特点&第三节第三节 药品分析方法的验证药品分析方法的验证&第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求第五章 药物定量分析与分析方法验证生物样品分析的特点生物样品分析的特点1．．干干扰扰物物质质多多——生生物物样样品品中中含含有有大大量量的的内内源源性性物物，，如如质质蛋蛋白白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析——样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析2．．样样品品量量少少、、不不能能重重复复取取样样——生生物物样样品品多多数数在在特特定定条条件件下下采采集，无法再次取样集，无法再次取样3．．被测成分浓度低被测成分浓度低——对分析方法的灵敏度及专属性要求较高对分析方法的灵敏度及专属性要求较高第五章 药物定量分析与分析方法验证1. 检测方法的高灵敏度检测方法的高灵敏度—最低检测量最低检测量10-9~10-7g或或10-15~10-12g2. 分离方法的高选择性、高专属性分离方法的高选择性、高专属性为满足各项要求，最常用的分析方法有为满足各项要求，最常用的分析方法有1）） 色色 谱谱 法法 ——GC、、 HPLC、、 HPCE（（ high-performance capillary electrophoresis））2）免疫分析法）免疫分析法——RIA、、EIA3）联用技术）联用技术——GC-MS、、LC-MS体内分析方法要求体内分析方法要求（（1）去除蛋白质）去除蛋白质(血样血样)①①加加与与水水混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂—蛋蛋白白质质分分子子内内和和分分子间氢键发生改变子间氢键发生改变. (乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)②②加加中中性性盐盐—蛋蛋白白质质脱脱水水. (饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等)③③加加强强酸酸—与与蛋蛋白白质质阳阳离离子子形形成成不不溶溶性性盐盐沉沉淀淀( 10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等)④④加含锌盐及铜盐的沉淀剂加含锌盐及铜盐的沉淀剂—与蛋白质阴离与蛋白质阴离    子形成不溶性盐沉淀子形成不溶性盐沉淀. (CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)⑤⑤酶酶解解法法—枯枯草草菌菌溶溶素素.适适用用于于酸酸不不稳稳定定及及蛋蛋白白结合牢固药物结合牢固药物.第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法（（2）缀合物的水解）缀合物的水解(尿样尿样)含羟基、羧基、氨基和巯基药物含羟基、羧基、氨基和巯基药物       + 葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸→葡萄糖醛酸苷缀合物葡萄糖醛酸苷缀合物含酚羟基、芳胺和醇类药物含酚羟基、芳胺和醇类药物       + 硫酸硫酸→ 硫酸酯缀合物硫酸酯缀合物第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法常用方法常用方法:酸水解酸水解:盐酸盐酸酶水解酶水解: 葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶               硫酸酯酶硫酸酯酶               葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶硫酸酯酶                        第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法（（3）分离纯化与富集）分离纯化与富集①①液液-液萃取法液萃取法水相水相pH值是萃取成功的关键值是萃取成功的关键水相最佳水相最佳pH值值          碱性药物：高于碱性药物：高于pKa值值1 2个个pH单位单位       酸性药物：低于酸性药物：低于pKa值值1 2个个pH单位单位第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法 但生物样品宜在碱性或近中性提取但生物样品宜在碱性或近中性提取——生物基质中内源性物质多为酸性，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取在碱性下不易萃取 空白血清在空白血清在pH2、、pH7和和pH13缓冲液中乙缓冲液中乙醚提取，提取液用醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱测定，碱性性(pH13)下提取液的杂质峰最少下提取液的杂质峰最少第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法空白血清乙醚提取物的空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图色谱图第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法②②液液-固提取法（固相萃取法）固提取法（固相萃取法）  原理：原理：     将将不不同同填填料料作作为为固固定定相相装装入入微微型型小小柱柱，，当当含含有有药药物物的的生生物物样样品品溶溶液液通通过过时时，，由由于于受受到到吸吸附附、、分分配配、、离离子子交交换换或或其其它它亲亲和和力力作作用用，，药药物物或或杂杂质质被被保保留留在在固固定定相相上上，，用用适适当当溶溶剂剂清清洗洗杂杂质质，，再再用用适适当当溶溶剂洗脱药物。

剂洗脱药物第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法(4)化学衍生化化学衍生化 化学衍生化目的化学衍生化目的①①使药物变成具有能被分离的特性使药物变成具有能被分离的特性②②提高对样品的检则灵敏度提高对样品的检则灵敏度③③增加药物的稳定性增加药物的稳定性④④提高对光学异构体的分离能力提高对光学异构体的分离能力第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法 （（5）有机破坏）有机破坏方法：湿法破坏方法：湿法破坏            干法破坏干法破坏            氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法 湿法破坏湿法破坏常用试剂常用试剂：硝酸或硝酸硝酸或硝酸-高氯酸高氯酸.特点特点：破坏能力强、反应激烈，无机破坏能力强、反应激烈，无机        金属离子为高价态金属离子为高价态.应用应用：适用于血、尿、组织等生物样适用于血、尿、组织等生物样        品的破坏品的破坏. 第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法高温炉高温破坏高温炉高温破坏应用应用——适合人发样品的破坏适合人发样品的破坏干法破坏干法破坏第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生生物物样样品品的的处处理理方方法法氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法应用应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等血浆、人发中卤素、硫、硒等  血浆：血浆血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上分次点于无灰滤纸上60℃                      烘干烘干,按规定折叠后固定按规定折叠后固定.人发：洗净、干燥（人发：洗净、干燥（60℃ ~ 80℃）剪碎）剪碎,            称取称取0.1 ~ 0.3g置无灰滤纸置无灰滤纸,按规定按规定             折叠固定折叠固定.生生物物样样品品的的处处理理方方法法第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理第五章 药物定量分析与分析方法验证生物样品定量分析方法验证内容与基本要求生物样品定量分析方法验证内容与基本要求1．特异性．特异性——避免干扰避免干扰2．标准曲线与线性范围．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围覆盖所有浓度范围3．准确度．准确度——与实际状况相符与实际状况相符4．精密度．精密度——结果可重现结果可重现5．定量限．定量限——达到峰浓度的达到峰浓度的1/10～～1/206．稳定性．稳定性——确保所有样品准确测定确保所有样品准确测定7．提取回收率．提取回收率——确保准确度确保准确度18一、方法特异性一、方法特异性方法的特异性方法的特异性(specificity)——又称专属性或专一性，通常与选择性又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用互用——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性专属性——表示所检测的表示所检测的信号信号(响应响应)系属于系属于待测药物所特有待测药物所特有的的选选择择性性——系系指指将将待待测测物物质质与与其其代代谢谢物物及及同同服服的的其其它它药药物物加加以以区区分分(分离分离)的能力的能力特异性特异性——涵盖二者，以涵盖二者，以验证验证所测定的物质与待测药物的所测定的物质与待测药物的同一性同一性考察一个分析方法是否具有特异性。

考察一个分析方法是否具有特异性第五章 药物定量分析与分析方法验证19二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围标准曲线标准曲线（（standard curve））—— calibration curve or working curve——生物样品中所测定药物浓度与响应的生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性相关性（比例的程度）（比例的程度）——通常用回归分析方法所得的通常用回归分析方法所得的回归方程回归方程来评价来评价——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式线性模式——回归分析法为回归分析法为最小二乘法最小二乘法（（least squares））或或加权最小二乘法加权最小二乘法（（weighted least squares））线性范围线性范围（（linear rang））——标准曲线的标准曲线的最高最高与与最低最低浓度的区间浓度的区间——模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第五章 药物定量分析与分析方法验证20二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围( (续续) )标准曲线标准曲线——用用模拟生物样品模拟生物样品建立建立 线性范围线性范围(不包括不包括零点零点)应能应能覆盖全部生物样品覆盖全部生物样品中的药物浓度中的药物浓度 不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度求算未知生物样品中的药物浓度 建立标准曲线所使用的模拟生物样品建立标准曲线所使用的模拟生物样品 应使用与待测的含药生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质相同的生物基质制备制备第五章 药物定量分析与分析方法验证21标准曲线的限度要求标准曲线的限度要求药代动力学或生物利用度研究药代动力学或生物利用度研究——标准曲线至少包括标准曲线至少包括5个浓度个浓度(通常为通常为5～～8个浓度个浓度,不包括零点不包括零点)——最最高高浓浓度度应应高高于于达达峰峰浓浓度度(Cmax)；；最最低低浓浓度度应应低低于于Cmax的的10%～～5%，并应为方法的，并应为方法的LOQ(非非LOD)——回归方程的截距应接近于零回归方程的截距应接近于零——相关系数要求相关系数要求  ≥0.99(色谱法色谱法)或或≥0.98(生物学方法生物学方法)——若若非非线线性性，，可可分分为为高高低低两两个个浓浓度度区区间间(每每个个区区间间不不少少于于5个个浓浓度度)，，分分别别加加权权回回归归——如如1、、2、、5、、10、、20和和10、、20、、50、、100、、200第五章 药物定量分析与分析方法验证22三、准确度三、准确度方法准确度方法准确度(accuracy)——系系指指用用该该方方法法测测得得的的生生物物样样品品中中待待测测药药物物的的浓浓度度与其真实浓度的接近程度与其真实浓度的接近程度——应应使使用用实实际际生生物物样样品品测测定定，，但但实实际际生生物物样样品品的的浓浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定——一一般般用用相相对对回回收收率率(relative recovery，，RR) 或或 相相对误差对误差(relative error，，RE)表示表示第五章 药物定量分析与分析方法验证231. 1. 测定法测定法取取空空白白生生物物基基质质（（如如血血浆浆））数数份份，，照照标标准准曲曲线线项项下下方方法法操作，用标准曲线计算操作，用标准曲线计算在标准曲线范围内制备质控在标准曲线范围内制备质控(quality control，，QC)样品样品——高高(接近上限接近上限)、中、低、中、低(接近接近LOQ) 3个浓度个浓度——每一浓度至少每一浓度至少5个样本个样本——与与随随行行的的标标准准曲曲线线同同法法测测定定、、计计算算，，每每个个样样品品分分析析测定测定1次次 第五章 药物定量分析与分析方法验证242. 2. 结果计算与限度要求结果计算与限度要求计算计算——测测定定值值M (measured)平平均均值值与与理理论论浓浓度度(加加入入值值)A(added)比比值值相对回收率相对回收率相对误差相对误差限度要求限度要求——相对回收率应在相对回收率应在85%～～115% (LOQ附近附近80%～～120%)——RE在在±15% (LOQ附近为附近为±20%)第五章 药物定量分析与分析方法验证2024/7/27体内药物分析25四、精密度四、精密度方法精密度方法精密度(precision )——系指每次测定结果与多次测定的平均值的系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度偏离程度——表示该分析方法的表示该分析方法的可重复性可重复性(reproducibility)——反映分析方法的反映分析方法的可操作可操作性，是方法验证的基本要点之一性，是方法验证的基本要点之一实际生物样品的量有限实际生物样品的量有限(如血浆，一般为如血浆，一般为0.5～～2ml)——使用模拟生物样品测定使用模拟生物样品测定 第五章 药物定量分析与分析方法验证261. 1. 表示方法表示方法方方法法精精密密度度一一般般用用标标准准偏偏差差(standard deviation，，SD)或或相相对对标标准偏差准偏差(relative standard deviation，，RSD)表示表示 SD=RSD= =——包包 括括 批批 内内 (within-run或或 intra-assay)RSD—日日 内内 (within-day) 批批间间(between-run或或inter-assay)RSD—日日间间(between-day，，day-to-day)第五章 药物定量分析与分析方法验证272. 2. 测定法测定法——分别测定法分别测定法(ⅠⅠ)照照准准确确度度项项下下方方法法，，取取空空白白生生物物基基质质(如如血血浆浆)数数份份，，分分别别在在同同一一批内和不同批间制备高、中、低批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的个浓度的QC样品，并分析测定样品，并分析测定批内批内RSD——每每一一浓浓度度5～～6个个样样品品，，每每个个样样品品测测定定1次次，，用用随随行行标标准准曲曲线线分别计算分别计算3个浓度及每个浓度及每1浓度的浓度的RSD批间批间RSD——每每1分分析析批批内内每每一一浓浓度度制制备备1个个样样品品，，每每个个样样品品测测定定1次次；；用用随行标准曲线计算随行标准曲线计算3个浓度个浓度(每一浓度每一浓度5～～6个分析批数据个分析批数据)的的RSD第五章 药物定量分析与分析方法验证282. 2. 测定法测定法——连续测定法连续测定法(Ⅱ)(Ⅱ)若若实实际际样样品品测测定定所所用用的的分分析析批批次次少少于于5批批，，也也可可进进行行3个个批批次次的的连续分析连续分析(每每1浓度的每浓度的每1批次为批次为5～～6个样本个样本)——方差分析法方差分析法 批间批间RSD =批内批内RSD = =第五章 药物定量分析与分析方法验证2024/7/27体内药物分析293. 3. 限度要求限度要求在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中对对 g/ml级水平的级水平的RSD一般应一般应≤10%ng/ml级水平的级水平的RSD一般应一般应≤15%在在LOQ附近附近RSD应应≤20%。

第五章 药物定量分析与分析方法验证30五、定量限五、定量限方法定量限方法定量限(limit of quantitation，，LOQ)——系系指指在在保保证证具具有有一一定定可可靠靠性性(准准确确度度与与精精密密度度符符合合要要求求)的的前前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度——又称为方法灵敏度又称为方法灵敏度(sensitivity)——标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点最低浓度点≥LOQ)要求要求 ——应能满足测定应能满足测定3～～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度个消除半衰期后生物样品中的药物浓度——准确度在准确度在80%～～120%(或或RE在在±20%的范围内的范围内)——RSD＜＜20%第五章 药物定量分析与分析方法验证31六、稳定性与质量控制六、稳定性与质量控制稳定性稳定性——包括方法稳定性和样品稳定性包括方法稳定性和样品稳定性方法稳定性方法稳定性——方法的耐用性方法的耐用性样品稳定性样品稳定性——生物样品的存放条件和时间、冻生物样品的存放条件和时间、冻-融循环融循环测定法测定法——QC样品穿插于实际样品测定全过程样品穿插于实际样品测定全过程——模拟模拟(或实际或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察要求要求 ——准确度准确度85%～～115%(RE在在±15%范围内范围内)，，RSD＜＜15%第五章 药物定量分析与分析方法验证32七、提取回收率七、提取回收率生物样品的预处理方法生物样品的预处理方法——重点考虑重点考虑方法准确度方法准确度(或或相对回收率相对回收率)，操作简便、快速，操作简便、快速——提取回收率提取回收率(绝对回收率，绝对回收率，absolute recovery)，，≥70%萃取回收率与相对回收率的意义不同萃取回收率与相对回收率的意义不同提取回收率提取回收率——考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失相对回收率相对回收率——采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度第五章 药物定量分析与分析方法验证331. 1. 测定法测定法取取空空白白生生物物基基质质(如如血血浆浆)，，照照准准确确度度项项下下方方法法，，制制备备高高、、中中、、低低3个浓度的个浓度的QC样品样品(每一浓度至少每一浓度至少5个样品个样品)，每个样品分析测定，每个样品分析测定1次次另另取取等等量量的的相相同同3个个浓浓度度的的标标准准溶溶液液，，用用溶溶解解模模拟拟生生物物样样品品经经提提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定AT——经萃取后的经萃取后的QC样品的检测信号或比值样品的检测信号或比值(内标法内标法)AS——未经萃取的标准溶液的检测信号或比值未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法内标法)第五章 药物定量分析与分析方法验证2024/7/27体内药物分析342. 2. 限度要求限度要求萃取回收率一般应萃取回收率一般应≥50%高、中浓度的高、中浓度的RSD应应≤15%低浓度的低浓度的RSD应应≤20%。

第五章 药物定量分析与分析方法验证35常用分析方法的特点常用分析方法的特点返回返回 分析方法的选择分析方法的选择分析方法分析方法检测限度检测限度/10-9g特异性特异性/分离能力分离能力紫外分光光度法（紫外分光光度法（UV））100－－荧光分光光度法（荧光分光光度法（Fluor））1±原子吸收光度法（原子吸收光度法（AA））1+薄层扫描法（薄层扫描法（TLSC））      紫外检测器（紫外检测器（UV））10++    荧光检测器（荧光检测器（Fluor））1++气相色谱法（气相色谱法（GC））      氢火焰离子化检测器（氢火焰离子化检测器（FID））1～～10++    氮磷检测器（氮磷检测器（N-PD））0.1～～0.01+++    电子捕获检测器（电子捕获检测器（ECD））0.01+++    质量碎片选择离子检测器（质量碎片选择离子检测器（MS））0.01++++高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC））      紫外检测器（紫外检测器（UV））1++    荧光检测器（荧光检测器（Fluor））0.1+++    电化学检测器（电化学检测器（ECD））0.01～～0.001+++免疫法（免疫法（IA））      放射免疫法（放射免疫法（RIA））0.01++    酶免疫法（酶免疫法（EIA））0.01++    荧光免役法（荧光免役法（FIA））0.01++第五章 药物定量分析与分析方法验证。