中华鲟野生群体及迁地群体的MHCⅠa基因遗传多样性变异研究.docx

中华鲟野生群体及迁地群体的MHCⅠa基因遗传多样性变异研究 肖衎+杜合军+赵珣+刘雪清+刘娟娟摘要：利用特异性引物MHCⅠf和MHCⅠr，分别从30尾野生中华鲟（Acipenser sinensis）、30尾中华鲟子一代和30尾中华鲟子二代的基因组DNA中扩增MHCⅠa基因的多肽结合位点（PBR）片段，扩增产物长度为127 bp中华鲟野生群体30个样品265个有效克隆中共检测出50条特异序列（单倍型），中华鲟子一代群体30个样品的278个有效克隆中共检测出66条特异序列（单倍型），中华鲟子二代群体30个样品的257个克隆中检测出64条特异序列（单倍型）单倍型Acsi-UAB*0101在3个群体中所占的百分比最高，分别为58.1%、38.8%和60.7%单倍型分布及群体内遗传多样性参数分析表明，中华鲟子一代群体的MHC基因遗传多样性最丰富，野生中华鲟群体的MHCⅠa基因遗传多样性较低中华鲟野生群体非同义替代与同义替代比率为1.33，分析表明正向选择可能是中华鲟MHCⅠa多态性的主要因素该研究结果提供了中华鲟从野生群体到子二代群体MHCⅠa基因的部分遗传信息和遗传变异规律，为中华鲟全人工种群优化和繁殖管理提供理论依据。

关键词：中华鲟（Acipenser sinensis）；主要组织相容性复合体（MHC）；遗传多样性；遗传管理：S965.215；Q75 ：A ：0439-8114（2017）02-0306-08中華鲟（Acipenser sinensis）是中国特有的古老大型海河洄游性鱼类，目前已处于极度濒危状态建立人工迁地种群是避免该物种在近期灭绝的一种方式，而人工群体往往面临家养化问题主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）是脊椎动物中与病原识别及防御、亲缘识别和婚配等适应性遗传密切相关的基因MHC基因包括两个典型的亚类和非典型的基因类，即典型的Ⅰ类基因、Ⅱ 类基因和补体类细胞因子等Ⅲ类基因，Ⅰ类基因与识别和递承内源性抗原相关，主要识别病毒类抗原MHC基因已成为近年来研究的热点基因，广泛用于疾病相关性、分子生态和进化、保护遗传、繁殖行为等研究领域[1-7]MHC Ⅰ类与MHC Ⅱ类基因家族中抗原结合区域（Peptide binding region，PBR）是其变异最高的区域在种群遗传多样性研究中，通常采用检测PBR水平来评价群体的MHC遗传多态性水平。

近年来，MHC基因多态性与鱼类抗病相关性也已有较多报道截至目前，国内关于MHC基因多态性和不同的等位基因与鱼类的抗病力相关性研究主要集中在牙鲆[8-11]Jia等[12]对德国镜鲤MHC Ⅰ、Ⅱ基因多态性也进行了研究李雪松等[13]和赵雪锦等[14]对“全红”和“粉玉”体色瓯江彩鲤MHC基因多态性与抗病性的关系进行了初步研究国外对此方面的研究则主要集中在少数几种鲑科鱼类：如虹鳟、大西洋鲑[15-20]对于鲟形目鱼类，目前仅一篇报道有关中华鲟和匙吻鲟的MHC Ⅰ基因进化研究[21]，在GenBank中有大西洋鲟（Acipenser oxyrinchus）和欧洲大西洋鲟（Acipenser sturio）的两条MHC Ⅱ基因序列（GenBank序列号分别为AJ515709.1、AJ515708.1）以及西伯利亚鲟（Acipenser baerii）MHC Ⅱ 3条基因序列（JO288773.1、JO288774.1、JO288775.1），对中华鲟MHC基因遗传多样性相关的研究还未见报道本研究拟在MHC Ⅰa PBR座位上对野生中华鲟及蓄养在中国长江三峡集团公司中华鲟研究所人工繁殖的中华鲟子一代种群和子二代种群为研究对象，通过分离和筛选中华鲟MHC Ⅰa基因座位，对野生群体及人工繁殖的中华鲟子一代和子二代3个不同种群的MHC Ⅰa遗传变异水平和遗传结构及野生种群与人工繁殖种群的遗传变异差异进行了分析，为中华鲟全人工种群优化和繁殖管理提供科学的依据。

1 材料与方法1.1 试验材料试验鱼来自中国长江三峡集团公司中华鲟研究所，16龄以上的中华鲟子一代30尾，亲本来源为1980～2000年的野生中华鲟；2009、2010和2011年从葛洲坝采集到的野生中华鲟鱼卵孵化的苗种各10尾，共计30尾；2011、2012、2013年中华鲟研究所全人工繁殖的子二代中华鲟幼苗各10尾，共计30尾分别采集少量鳍条，用无水乙醇固定1.2 引物设计根据Wang等[21]报道的中华鲟MHC Ⅰa基因cDNA序列，利用Primer6.0设计中华鲟MHC Ⅰa基因PBR区特异引物：MHCⅠf（5′-TTTGAGTCCCTTGAGGCG-3′）和MHC Ⅰr（5′-TACAGACGAGCCGTGGAA-3′），目的片段大小为127 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成1.3 DNA提取和PCR扩增将无水乙醇固定保存的鳍条样品剪碎，于70 ℃烘干使乙醇完全挥发Qiagen基因组DNA提取试剂盒依据其说明书进行基因组DNA提取1.0% Agarose凝胶电泳检测后，并检测其浓度和纯度，然后将DNA浓度调整至200 ng/μL，-20 ℃保存备用PCR反应总体积为50 μL，正、反引物各0.4 μmol/L，模板DNA为40 ng。

PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min1.4 PCR产物的克隆与测序50 μL的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，用Omega Gel Extraction Kit回收试剂盒进行回收将回收产物按约3∶1的比例与pMD19-T（TakaRa）载体进行连接，然后将连接产物5 μL用于转化Ecoli DH5α感受态细胞根据蓝白斑原理，筛选白色菌斑，接种至3 mL液体培养基过夜培养，用M13+/-引物菌液PCR检测，鉴定含插入片段的菌株菌液送至上海英骏生物工程有限公司采用自动测序仪进行双向测序 1.5 序列分析获得的序列通过NCBI中BLAST同源检索，确认是否为目的片段用Clustal w进行多序列比较，利用MEGA 7.0软件分析DNA序列和氨基酸序列的变异位点，并辅以人工校对利用DNasp 5.1进行基因多态性分析和选择压力分析， 利用MEGA 7.0软件采用kimura双参数模型构建邻接（Neighbor joining，NJ）系统发育树2 结果与分析2.1 PCR序列扩增对90尾中华鲟的900个有效克隆进行了测序和分析，经过在GenBank中Blast保守区结构域（Conserved domains）比对后发现扩增得到的序列位于中华鲟MHC Ⅰ基因α1-2结构域内，确认其为中华鲟MHC Ⅰa基因PBR区内的片段。

序列经对位排列和变异检测后，没有发现任何插入、缺失或异常的密码子该核苷酸序列长度为127 bp，编码42个氨基酸2.2 MHC Ⅰa单倍型分离情况中华鲟野生群体30个样品265个有效克隆中共检测出50条特异序列（单倍型），中华鲟子一代群体30个样品的278个有效克隆中共检测出66条特异序列（单倍型），中华鲟子二代群体30个样品的257个克隆中检测出64条特异序列（单倍型）MHC Ⅰa单倍型分离情况见表12009年野生樣品编号为A1-A10；2010年野生样品编号为B1-B10；2011年野生样品编号为C1-C102011年子二代样品编号为D1-D10；2012年子二代样品编号为E1-E10；2013年子二代样品编号为F1-F10子一代样品编号为G1-G30中华鲟3个群体共有单倍型序列7条，其中Acsi-UAB*0101、Acsi-UAB*0103和Acsi-UAB*0105为主要优势单倍型，Acsi-UAB*0101单倍型数量占野生群体有效克隆总数的58.1%，Acsi-UAB*0103单倍型数量占野生群体有效克隆总数的10.9%，Acsi-UAB*0105单倍型数量占野生群体有效克隆总数的7.6%；Acsi-UAB*0101和Acsi-UAB*0103也是中华鲟子一代群体和子二代群体的优势单倍型，分别占子一代群体总数的38.8%和31.7%，占子二代群体总数的60.7%和10.1%。

3个主要单倍型在中华鲟3个群体中的分布比例见表22.3 3个群体序列多态性和遗传多样性图1是中华鲟野生群体50个单倍型的核苷酸序列比对结果，127 bp的核苷酸序列比对后发现有53个变异位点，变异率为41.73%其中转换位点25个，颠换位点18个，既有转换又有颠换的位点10个图2是中华鲟野生群体50个单倍型的氨基酸序列比对结果，翻译后序列长为42个氨基酸，在23个氨基酸位点发生替代，氨基酸序列多态性为54.76%图3是中华鲟子一代群体66个单倍型的核苷酸序列比对结果，127 bp的核苷酸序列比对后发现有64个变异位点，变异率为50.39%其中转换位点30个，颠换位点24个，既有转换又有颠换的位点10个图4是中华鲟野生群体66个单倍型的氨基酸序列比对结果，翻译后的42个氨基酸序列在26个氨基酸位点发生替代，氨基酸序列多态性为61.90%图5是中华鲟子二代群体64个单倍型的核苷酸序列比对结果，127 bp的核苷酸序列比对后发现有62个变异位点，变异率为48.82%其中转换位点31个，颠换位点22个，既有转换又有颠换的位点9个图6是中华鲟野生群体66个单倍型的氨基酸序列比对结果，翻译后的42个氨基酸序列在24个氨基酸位点发生替代，氨基酸序列多态性为57.14%。

对3个中华鲟种群的遗传多样性分析显示（表3）：单倍型数目H最大的为子一代群体（66），其次为子二代群体（64），第三为野生群体（50）；单倍型多样性h最大的为子一代群体（0.937），其次为子二代群体（0.898），第三为野生群体（0.879）；核苷酸多样性指数π最大的为子一代群体（0.056），其次为野生群体（0.043），第三为子二代群体（0.015）整体而言，子一代种群的各遗传多样性参数最高；子二代群体单倍型数和单倍型多样性较野生群体更高，但是核苷酸多样性、平均核苷酸差异数则低于野生群体2.4 同义替代和非同义替代利用DNasp 5.0计算中华鲟MHC Ⅰa序列中的同义替代率（dn）和非同义替代率（ds），中华鲟野生群体的dn/ds为1.33，中华鲟子一代群体的dn/ds为1.03，中华鲟子二代群体的dn/ds为1.04（表4）2.5 系统发育树图7、图8和图9分别是中华鲟3个群体MHC Ⅰ基因基于kimura双参数模型构建邻接（Neighbor joining，NJ）系统发育树中华鲟3个群体MHC Ⅰ基因明显地被分为两大类群，推测中华鲟 MHC Ⅰ基因可能存在两个基因座位由于部分单倍型序列差异较小，导致系统发育树某些节点自展值较低。

3 讨论3.1 中华鲟MHC Ⅰ基因多态性目前，有关鱼类MHC基因多态性的研究较多庞纪彩等[22]从广东省 3 个不同罗非鱼养殖地区采集的137尾尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的个体基因组中扩增出长度为775～796 bp片段的MHC ⅡB核苷酸序列，共检测出49个单碱基突变位点；张玉喜等[9]对牙鲆84个个体的411个阳性克隆进行测序，发现有13种不同的MHC ⅡB核苷酸序列，分别编码13种不同的氨基酸序列杨玲等[23]从扩增的262 bp的草鱼MHC Ⅰ基因核苷酸序列中，发现50个多态位点（19%），低于本研究变异率最小的野生群体（41.73%）本研究中华鲟3个群体90个个体的800个克隆，共发现有157种不同的MHC Ⅰ核苷酸序列，表现出了丰富的基因多态性中华鲟种群MHC Ⅰ基因多态性比。