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鸟嘌呤四链体在生化分析中的应用进展 刘卓靓 陶呈安 王建方摘要鸟嘌呤四链体（G-四链体）是一种特殊的核酸二级结构，它可与高铁血红素结合，形成具有过氧化物酶活性的核酶; 也可增强特殊结构染料的荧光强度G-四链体作为功能核酸中的一种，具有性质稳定、特异性好、功能多样等特点，被广泛应用于各种生化分析中本文对近年来G-四链体在生化分析中的研究和应用进展进行了评述，对其应用前景进行了展望关键词G-四链体; 功能核酸; 核酶; 生化分析; 评述1引 言随着现代医学的发展，特定核酸、蛋白、酶等的检测，已成为某些疾病的直接或间接诊断指标[1～3]而传统的检测方法，如高效液相色谱法、聚合酶链式反应（PCR）、免疫印迹法、电泳法[4～6]都涉及专业人员操作以及大型仪器的使用，存在检测时间长、操作复杂、检测灵敏度不高等问题而比色法及荧光法[7，8]作为仪器分析中的经典方法，重复性好、操作简单，易于试剂盒的开发比色法或荧光法中如何高效稳定输出信号的报告分子是分析方法的研究热点功能核酸鸟嘌呤四链体（G-四链体）的特殊理化性质，如与高铁血红素结合生成具有过氧化物酶活性的核酶、增强特殊结构染料的荧光强度等，可灵活地实现信号的稳定输出。

利用G-四链体作为报告分子，与各种功能核酸或核酸信号放大方法联用，可实现多种目标分子高特异性、高灵敏的检测，为多种生化分析提供快速、简便的检测方法本文首先介绍了G-四链体的分类和功能，以及利用其与金属离子作用引起的结构变化而导致性质的变化，结合特定染料或药物分子的性质，与其它功能核酸联用等，在小分子、蛋白质、酶、金属离子、目标DNA或RNA检测、细胞成像及癌症治疗等方面应用的研究进展进行了评述2G-四链体简介2.1G-四链体的分类鸟嘌呤平面是由4个鸟嘌呤通过氢键构成的方形平面，G-四链体由几个鸟嘌呤平面堆叠而成，其结构由处于平面之间的金属离子形成稳定金字塔结构 [9]中心稳定离子为一价或者二价金属离子，其中K+是最常见的金属离子，金属离子的大小决定G-四链体结构的稳定性[10，11]根据形成G-四链体的DNA或RNA链的数目分类，由一条链形成四链体结构称为分子内G-四链体，多条链构成的称为分子间G-四链体根据链的走向可分为3类：当四条链的方向均相同时，为平行结构; 当两条链方向相同，另两条链与其方向相反时，为反平行结构; 其它情况称为混合平行结构（图1）[12，13]G-四链体的结构可通过圆二色谱测定。

所有的G-四链体结构在210 nm处都有一个正的特征吸收峰平行结构的G-四链体在240 nm处有一个负吸收峰，在260 nm附近有一个正吸收峰; 反平行结构的G-四链体在260 nm处有一个负吸收峰，在290 nm处有一个正吸收峰[14]G-四链体的结构主要取决于DNA或RNA的序列、核酸链的浓度和稳定离子的种类[15]以稳定离子种类为例，Kong等[16]发现同样的序列在K+或Na+条件下形成不同的结构，他们系统研究了以T为间隔的碱基序列（5′-G3TiG3TjG3TkG3-3′）当T的总数目≤5时，在100 mmol/L的K+和Na+条件下均形成平行结构; 当T的总数目为6～7时，在K+存在下依然形成平行结构G-四链体; 而Na+稳定时折叠成混合平行结构 Li等[17]发现，PW17在K+存在下形成平行结构G-四链体，而Pb2+条件下为反平行结构2.2G-四链体的性质2.2.1G-四链体构成的模拟酶具有酶催化活性的DNA或RNA稱为核酶（DNAzyme/RNAzyme）[18]目前已发现具有切割或连接DNA/RNA、模拟过氧化物酶等活性的核酶[19～21]G-四链体与辅因子高铁血红素（Hemin）结合形成具有过氧化物酶活性的核酶，可催化多种底物的氧化，包括ABTS、TMB、AmplexRed、鲁米诺等。

这种核酶是Travascio等[22]在筛选可特异结合N-甲基化卟啉IX的核酸适配体时发现的，而后进一步优化得到18个碱基的核酸适配体PS2.MPS2.M形成的G-四链体与Hemin构成的核酶，其催化活性是Hemin单独存在时的250倍[23]此类核酶的催化反应机理与辣根过氧化物酶类似，G-四链体模拟辣根过氧化物酶中的组氨酸残基为Hemin中的Fe提供一个轴向配体和一个疏水环境，有利于OO的异裂G-四链体为Hemin提供一个平面结构，有利于氢的交换[24～26]目前，对于此类核酶的活性调控主要有3种方法：（1）是改变G-四链体本身的序列，从而改变其拓扑结构来影响其性质; （2）是改变稳定中心离子，从而改变G-四链体的构型而改变Hemin的结合情况; （3）是在G-四链体的序列末端增加腺嘌呤，可将其活性提高至原有活性的4倍[24]另外，还可加入ATP来稳定催化过程中产生的自由基，提高催化效率[27]2.2.2G-四链体增强荧光的染料G-四链体可结合一些特定的荧光染料，极大地增强染料自身的荧光强度， 例如卟啉衍生物、酞菁染料、结晶紫、三苯甲烷等染料荧光增强的原理是G-四链体可为染料分子提供一个疏水环境，防止荧光分子的相互靠近导致的自淬灭现象。

结晶紫（Crystal violet， CV）是一种三苯甲烷染料，堆积在两个鸟嘌呤平面之间，可区分平行和反平行G-四链体反平行G-四链体的Loop环可结合CV使其不受溶剂的影响，使得荧光大大增强而平行G-四链体侧链的Loop环不能结合CV，使得CV的荧光增强明显弱于结合反平行G-四链体的CV[16]硫磺素T（Thioflavin T， ThT）是一种水溶性染料，可特异性地识别并结合G-四链体，结合后其荧光强度可增大2500倍[28]Z）-4-（3，5-difluoro-4-hydroxybenzylidene）-1，2-dimethyl-1H-imidazol-5（4H）-one（DFHBI）是一种可与RNA G-四链体结合并对其进行特异性识别的染料分子，结合后可模拟绿色荧光蛋白的荧光，用于细胞中的RNA成像[29]在此基础上，Feng等[30]报道了6种与红色荧光蛋白生色团类似的染料分子，与G-四链体结合后发出的荧光光谱范围几乎覆盖红色荧光蛋白的发射光谱，并且有较高的荧光量子产率，以此可模拟红色荧光蛋白，实现细胞内成像2.2.3G-四链体降低电信号的电化学活性分子亚甲基蓝（Methylene blue，MB）是一种带正电的芳香结构，是一种常用的电化学信号分子。

Zhang等[31]研究发现，由于G平面的末端π-π堆叠效应，MB可竞争Hemin结合到G-四链体上，显著减少扩散到电极表面的MB，从而使得电流下降3G-四链体在生化分析中的应用3.1小分子与蛋白质的检测核酸适配体是经体外筛选，可高特异性和高亲和力地识别并结合目标分子的单链DNA或RNA以G-四链体为信号分子检测小分子和蛋白质的传感分析方法大多与核酸适配体单元联用如Willner研究组[32]将ATP的核酸适配体连接上一段G-四链体序列作为识别探针，另一条DNA与之部分杂交形成中间留有环状结构的双链结构当ATP存在时，核酸适配体与ATP结合，识别探针从双链上解离下来，释放出的G-四链体与Hemin形成DNAzyme，催化底物反应（图 2）利用类似的设计，可实现可卡因、溶菌酶、细胞因子[33～35]等的检测在此类设计中，要求仔细筛选G-四链体和核酸适配体中被双链结构封闭的碱基数目，使得在有目标分子条件下G-四链体可从双链解离产生信号，而无目标分子时，G-四链体不会自动解离产生较高的背景信号值得注意的，凝血酶有两种长度分别为15及29个碱基的核酸适配体，且都可形成G-四链体结构Li等[36]利用凝血酶的核酸适配体结合凝血酶后，可促进核酸适配体形成的G-四链体，并更好地结合Hemin以提高DNAzyme的催化活性，从而实现凝血酶的检测。

3.2酶活性的分析酶是生命过程中不可或缺的一部分，各种疾病的发生都与酶活性的异常相关，因此酶活性的检测是生化分析中的重要内容以G-四链体为信号分子分析酶活性的报道中，检测对象大多是以核酸为底物的酶以下介绍几种在疾病诊断、分子生物学中有重要意义的酶的检测方法3.2.1T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）T4 PNK是一种双功能酶，可移除3′磷酸基团以恢复3′羟基基团，也可实现5′磷酸化Liu等[37]报道了一种基于G-四链体-DNAyzme比色检测T4 PNK的方法在该体系中，设计了两条探针，一条是3′磷酸化的引物，一条是封闭有G-四链体序列的发夹探针当T4 PNK存在时，引物的3′磷酸被去磷酸化，生成3′羟基，此时聚合酶可将引物延伸打开发夹，释放G-四链体序列该方法可检测低至0.01 U/mL的T4 PNK基于T4 PNK5′磷酸化活性，裴仁军研究组[38]设计了一种裂分的G-四链体 DNAzyme检测体系，实现最低浓度0.014 U/mL的T4 PNK的检测3.2.2核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ，Exo Ⅲ）Exo Ⅲ具有从3′-5′方向切割DNA的活性，在DNA复制等生理过程中有重要意义。

Leung等[39]设计了发夹茎部含有G-四链体结构的探针用于分析ExoⅢ的活性核酸内切酶Ⅲ从发夹茎部的3′端切断，最后剩下的单链部分即为G-四链体，與CV结合后大大增加其荧光，以此来检测核酸内切酶Ⅲ的活性（图3A）3.2.3DNA连接酶（DNA ligase）DNA连接酶能催化DNA分子内或分子间毗邻的5′磷酸基团和3′羟基基团形成磷酸二酯键， 将两段相邻的DNA拼合成一条完整的DNA链He等[40]利用DNA连接前后对于发夹结构的改变，开发了基于G-四链体检测DNA连接酶的方法（图3B），最低可检测0.2 U/mL的DNA连接酶3.2.4DNA甲基化酶（DNA methyltransferase）DNA甲基化酶能识别特定序列中的胞嘧啶或腺嘌呤，并将甲基共价连接到该碱基上，可调控基因表达Li等[41]利用DNA甲基化酶识别发夹结构中的甲基化位点并对其甲基化，然后特异性切割酶DpnI识别被甲基化的碱基对其切断，将G-四链体短片段释放出来，可实现6 U/mL DNA甲基化酶的检测为进一步降低检出限，引入聚合酶形成分子机器，通过识别甲基化后的片段DNA，进行多次的聚合及切割，可检测更低浓度的甲基化酶，检出限为0.25 U/mL。

3.2.5焦磷酸酶（Pyrophosphatase， PPase）PPase是作用于双磷酸键上的酸酐水解酶， 可催化一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子Wang等[42]根据Cu2+与焦磷酸配位形成Cu-Ppi复合物，而焦磷酸的水解产物磷酸不结合Cu2+，PPase作用后Cu2+从复合物上释放出来，作为稳定G-四链体结构的中心离子，催化TMB与H2O2反应，实现了PPase的检测，检出限为0.0006 U/mL（图3C）3.2.6碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）ALP可催化核酸分子脱去磷酸基团，从而转变为羟基末端Liu等[43]利用其能产生自由羟基末端的性质开发了一种以G-四链体为信号分子的电化学传感器ALP将杂交在电极上的DNA的磷酸基团除去形成羟基，再加入脱氧核糖末端转移酶延伸得到长链的T序列，此时加入一段末端为polyA的G-四链体探针即能杂交到长链T上，G-四链体与Hemin形成DNAzyme催化电极表面Thi的氧化， 实现信号的输出此方法可实现最低浓度为0.00003 U/mL的ALP的检测3.2.7尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil -DNA Glycocasylase， UDG）UDG能特异性识别并除去DNA单链或双链的尿嘧啶残基。