雌激素诱发大鼠催乳素瘤的机制与研究.doc

1雌激素诱发大鼠催乳素瘤的机制与研究【摘要】 目的 通过分析雌激素对大鼠垂体 Pit 1 基因表达的作用，探讨雌激素诱发大鼠催乳素瘤的发病机制方法 成年雌性 Wistar 大鼠，去势手术后分 2 组：(1) 对照组(C 组，n=16)皮下植入空白硅胶管；(2) 雌激素组(E 组，n=16)：皮下植入含有乙稀雌酚的硅胶管分别于用药第 2、4、6、8 周处死动物垂体称重用放免法测定大鼠血清 PRL 水平用反转录 PCR 方法检测 Pit 1 mRNA 在各组垂体组织中的表达量结果 在用药第 2、4、6、8 周，大鼠血清 PRL 水平、垂体重量、垂体组织 Pit 1 mRNA 水平均逐渐增高，垂体组织 Pit 1 mRNA 水平与大鼠血清 PRL水平和垂体重量均呈明显正相关(相关系数分别为 0.946 和 0.913，P=0.01)结论 雌激素刺激垂体组织表达 Pit 1 基因， Pit 1 在雌激素诱发的大鼠 PRL 瘤的发生中起重要作用 【关键词】 发病机制；大鼠；催乳素瘤；雌激素；Pit 1The Mechanism of Estrogen on Estrogen Induced Prolactinomas in RatsAbstract：Objective To study the mechanism of estrogen on estrogen induced prolactinomas in rats.Methods Adult Wistar rats were divided into 2 groups at random.Each rat in control group(n=16)were subscutaneously implanted with a blank implant.Rats in estrogen group（n=16） were implanted with estrogen containing implants.The animals were executed after 2,4,6,8 weeks.Serum prolactin(PRL) levels were measured by RIA method.Pit 1 mRNA level in pituitary tissue were measured by RT PCR method.Results Pit 1 mRNA levels were different among 2,4,6,8 weeks and increased along with 2,4,6,8 weeks.There was a positive relation between Pit 1 mRNA levels and serum PRL levels (γ= 0.964,P=0.01).There was also a positive relation between Pit 1 mRNA levels and pituitary weights(γ= 0.913，P=0.01). Conclusion Estrogen has a stimulating effect on the expression of Pit 1 gene,which plays an important role on estrogen induced prolactinoma.Key words：Mechanism;Estrogen;Prolactinomas;Rats;Pit 1雌激素是垂体催乳素（PRL）细胞增生和 PRL 基因表达强有力的刺激因子,雌激2素作用于垂体 PRL 细胞上的雌激素受体，雌激素 雌激素受体复合物通过细胞内的一系列生物学效应引起 PRL 的分泌和 PRL 细胞的增生，最终形成 PRL 瘤。

雌激素 雌激素受体复合物通过何种途径或与何种因子共同作用导致 PRL 的分泌和 PRL 细胞的增生？最近研究发现，在 PRL 基因的近端启动子和远端增强子存在 Pit 1 特异性的结合部位,PRL 基因的正常表达需要 Pit 1 蛋白与雌激素 雌激素受体的协同作用[1，2]本研究通过分析 Pit 1 基因在雌激素诱发的大鼠 PRL瘤中的表达,探讨雌激素对垂体 PRL 细胞的作用机制 1 材料与方法1.1 大鼠 PRL 瘤的制备成年雌性 Wistar 大鼠，体重 120～150g，腹腔内注射 10%水合氯醛50～80mg/kg，大鼠完全麻醉后,常规消毒,于背部腰椎两侧做长约 2～3cm 的纵形切口,暴露腹腔,结扎子宫,切除卵巢,并逐层缝合于其背部中线尾骨上约 3cm 偏左处作一约 1cm 长纵形口切，并游离皮下组织，随机将一含有乙稀雌酚 20mg 的硅胶管(长 2cm,内径 1.5mm,外径 2.41mm)或空白硅胶管植入皮下全部动物分 2 组：(1) 对照组(C 组，n=16)皮下植入空白硅胶管；(2) 雌激素组(E 组，n=16)：皮下植入含有乙稀雌酚的硅胶管分别于用药第 2、4、6、8 周用乙醚麻醉大鼠，心脏穿刺取血分离血清于-70℃保存，打开颅骨，摘下垂体，称重后将一半冻于液氮中,一半放于 4%多聚甲醛中固定。

1.2 血清 PRL 水平的测定大鼠血清 PRL 放免测定的抗原和抗体由 NHPP 惠赠用氯胺 T 法标记催乳素抗原,灵敏度为 0.54ng/ml,批内 CV 为 6.8%,批间 CV 为 8.7%31.3 垂体组织中 Pit 1 mRNA 表达量的检测1.3.1 总 RNA 的提取垂体组织 15～30mg,用异硫氢酸胍一步法提取,RNA 提取试剂盒(Trizol)购自GIBCORL 公司计算 RNA 含量（1 OD280=40μg/ml）1.3.2 模板 cDNA 的合成总 RNA 2μg 中加入 OligdT 0.5μg,置于 70℃预变性 5min，然后在冰浴中,依次加入以下反应物:5×Buffer 4μl,10×dNTP 2μl,RNasin 20U(购自 Promega 公司),AMV 10U(购自 Promega 公司),反应总体系为 20μl于 42℃ 1h,98℃ 5min 灭活反转录酶，RT 产物于-20℃保存1.3.3 目的基因的扩增(PCR)Pit 1 基因的上游引物为 5' CACCTCGGCTGATACCTTT 3',下游引物为' GTTTGCTCCCACTTTTTC 3'[3],扩增产物为 616bp。

在 25μl 的反应体系中依次加入 10×Buffer 2.5μl，2.5×dNTP 3μl,引物(上游和下游各)20pmol,逆转录产物0.5～3μl 标和无菌去离子水,混匀,加液体石腊油覆盖,进行 PCR 扩增反应98℃ 10min 预变性后在 88℃下 加 Taq 酶(1/管)，以 β actin 做内对照，上游引物为5' CGTTGACATCCGTAAAGA 3'，下游引物为5' AGCCACCAATCCACACAG 3'于 94℃变性 1min，56℃退火 1min，72℃延伸 1.5min1.3.4PCR 产物的检测4制备 1.5%的琼脂糖凝胶,含溴化乙啶 0.5μg/ml,PCR 产物与载体缓冲液比例为6∶1,在 70V 恒压电泳 20min,于 UVP 计算机图像分析系统测定样本灰度值,以β actin 作为内参照,计算相对含量1.3.5 统计学分析所有实验数据以均数±标准差表示,用 SPSS 统计软件分析，两组间差异用 t 检验，多组间差异用方差分析，用回归分析方法判断两因素之间是否存在相关性 2 结果见图 12.1 大鼠垂体重量的比较在用药 2、4、6、8 周，C 组大鼠垂体重量分别为（14.2±1.8）mg、(15.7±1.7)mg、(14.4±2.0)mg 和(13.0±1.6）mg,无明显差别(F=1.61,P=0.239)；E 组垂体重量分别为（21.5±3.2）mg、 （30.6±3.1）、(45.5±8.7)mg、(74.1±8.4)mg 呈逐渐增加的趋势，有统计学差别(F=53.055,P0.001)。

在用药 2、4、6、8 周，E 组垂体重量均分别高于 C 组,具有统计学差别，t 值分别为 5.934、8.381、6.997 和 14.225，P 值分别为0.001、0.001、0.001 和0.0012.2 大鼠血清 PRL 水平的比较在用药 2、4、6、8 周，C 组大鼠血清 PRL 水平分别为（18.3±5.1）μg/L、 （23.6±7.0）μg/L、 （22.4±4.5）μg/L、 （25.9±8.8）μg/L 无明显差别（F=0.939，P0.001）；E 组血清PRL 水平分别为（152.4±65.1）μg/L、 （791.9±124.1）μg/L、 （2235.9±229.0）5μg/L、 （4622.8±712.6）μg/L，呈逐渐增加的趋势，有统计学差别（F=108.518，P0.001）E 组大鼠血清 PRL 水平均分别高于 C 组,有统计学差别，t 值分别为 4.109、12.363、19.382 和 12.901，P 值分别为0.006、0.001、0.001 和0.0012.3Pit 1 mRNA 在垂体组织中表达水平的比较用 2%琼脂糖凝胶电泳检测 RT PCR 产物,以大鼠脂肪组织做阴性对照，E 组和 C 组标本在 616bp 处均有清晰的带型，说明 Pit 1 mRNA 在两组大鼠垂体组织中均有表达,见图 2。

在用药 2、4、6、8 周，C 组大鼠垂体组织 Pit 1 mRNA 水平分别为0.8±0.4、1.0±0.4、1.2±0.4、0.8±0.4，无明显差别（F=0.870，P=0.484）E 组 Pit 1 mRNA 水平分别为 1.4±0.4、2.6±0.1、3.4±0.2、5.5±0.4，呈逐渐增加的趋势，具有统计学差别（F=123.850，P0.001）在用药 2、4、6、8 周，E 组 Pit 1 mRNA 水平均分别高于 C 组，具有统计学差别，t 值分别为 2.504、7.735、10.371 和 16.726，P值分别为 0.046、0.001、0.001 和0.0012.4Pit 1 mRNA 水平与血清 PRL 值的关系E 组大鼠垂体组织 Pit 1 mRNA 水平与大鼠血清 PRL 值呈正相关，相关系数为0.964（P=0.01）2.5Pit 1 mRNA 水平与大鼠垂体重量的关系E 组大鼠垂体组织 Pit 1 mRNA 水平与垂体重量呈明显正相关，相关系数为0.913（P=0.01）63 讨论Pit 1 蛋白是 POU ( Pit 1,Oct 1，Oct 2 and Unc 86 的缩写)家族的成员之一，是垂体特异的转录因子。

对垂体生长激素（GH）细胞、PRL 细胞以及促甲状腺素（TSH）细胞的发育、分化和增生均有重要的调节作用[4，5]有报道 Pit 1 基因在人垂体 PRL 瘤和 GH 瘤中的表达量明显增高,提示 Pit 1 对人垂体 GH 和 PRL 腺瘤细胞分化和增生具有一定的作用[6]本研究发现，在雌激素诱发大鼠 PRL 瘤的过程中，大鼠垂体组织 Pit 1 mRNA 水平逐渐增高，Pit 1 的表达量分别与大鼠血清 PRL 水平和垂体重量呈明显的正相关,提示 Pit 1 与大鼠垂体 PRL 基因的表达和 PRL 细胞的增生密切相关Pit 1 的表达受性激素的调节雄性大鼠去势后,垂体组织的 Pit 1 mRNA 水平明显下降,补充生理剂量睾酮可以阻止其下降[7]本研究用去势的雌性大鼠为研究对象,在雌激素的作用下，垂体 PRL 瘤组织 Pit 1 基因的表达量逐渐升高,说明雌激素刺激垂体组织 Pit 1 基因的表达体外培养研究发现，雌激素直接刺激Pit 1 mRNA 的表达,双氢睾酮(DHT)则不。