化妆品口腔黏膜刺激试验方法.docx

附件6口腔黏膜刺激试验方法Oral mucous irritation test1 范围 本方法适用于评价牙膏对口腔黏膜组织潜在的刺激作用2 试验目的确定和评价牙膏对动物口腔黏膜组织是否有刺激作用及其程度3 定义口腔黏膜刺激 oral mucosa irritation口腔黏膜组织接触受试物后所产生的水肿、炎性变化及组织损伤等反应4 试验的基本原则将受试物置于受试动物的一侧颊囊内，对照物置于另一侧颊囊内，在规定的时间间隔内多次接触，肉眼观察并记录动物颊囊接触部位的刺激程度，并于末次接触后24小时取材进行组织学评价5 试验方法5.1 试样5.1.1 受试物：受试物直接使用，单次放置量为0.4 g或0.4 mL5.1.2 对照物：0.9%氯化钠注射液（生理盐水），用量同受试物，直接使用5.2 实验动物和饲养环境5.2.1 健康的SPF级金黄地鼠（拉丁学名：Mesocricetus auratus），6 ~8周龄同一品系，雌雄不限，雌性动物应未孕5.2.2 至少使用3只动物5.2.3 试验前动物应在实验动物房环境内至少适应3天实验动物及实验动物房应符合国家相关规定选用标准配合饲料，饮水不限制。

5.3 试验步骤5.3.1 动物准备与麻醉用适当的麻醉剂麻醉动物，检查动物双侧颊囊有无异常（剔除颊囊黏膜异常的动物）翻转动物颊囊用生理盐水或蒸馏水清洗干净后进行试验5.3.2 试样接触5.3.2.1 将受试物置于动物一侧颊囊底部，对照物置于另一侧颊囊底部试样与黏膜接触5 min，接触时间结束后将颊囊翻出，去除试样，用生理盐水或蒸馏水清洗接触部位，清洗时间一般为1 min~2 min，直至将试样完全清除重复上述操作4次，每次操作间隔1 h（含接触与清洗时间）每次重复放置试样前肉眼检查颊囊，并记录异常情况末次接触后的24 h肉眼观察颊囊并取与试样接触的颊囊组织进行组织学评价5.3.2.2 在5.3.2.1试验过程中，根据表1判定肉眼观察结果在试验周期内的任意时间点，3只动物中如有1只及以上出现重度水肿、红斑、糜烂或溃疡现象，可直接判定为重度口腔黏膜刺激反应，无需再进行组织学评价5.4 结果观察5.4.1临床观察5.4.1.1 试验期间观察动物，记录异常表现，包括局部、全身及异常行为等5.4.1.2 肉眼观察试验部位，根据表1判定有无红斑、水肿、糜烂及溃疡等情况，并比较同一动物的试验侧颊囊和对照侧颊囊，记录每侧颊囊的状况，注意试验侧与对照侧的差异。

表1 口腔黏膜临床观察评价表临床表现反应程度红斑无红斑无极轻微红斑（勉强可见）极轻清晰红斑轻度中度红斑中度重度红斑（紫红色）至焦痂形成、糜烂、溃疡重度水肿无水肿无极轻微水肿（勉强可见）极轻清晰水肿（肿起边缘清晰）轻度中度水肿（肿起约1 mm）中度重度水肿（肿起超过1 mm，并超出接触区）重度5.4.2 组织学观察5.4.2.1 组织切片制作末次接触后24 h，取试样接触部位的颊囊，10%中性福尔马林缓冲液固定，常规石蜡包埋，半连续切片，间隔取片5张，H-E染色5.4.2.2 组织学观察及记分对黏膜组织进行组织病理学观察，并根据口腔黏膜组织反应记分表（表2）计算每只动物得分其中白细胞浸润情况应至少在20倍物镜下选取3 ~5个有代表性的视野观察，每只动物的得分为所有观察视野的平均分将试验组中所有动物的组织反应记分相加之和，再除以试验动物总数，得出试验组平均记分，对照组同法计算表2 口腔黏膜组织反应记分表组织反应记分上皮正常，完好无损0细胞变性或变扁平1组织变形2局部糜烂3广泛糜烂4白细胞浸润无0极少（少于25）1轻度（26～50）2中度（51～100）3重度（大于100)4血管充血无0极少1轻度2中度3重度伴血管破裂4水肿无0极少1轻度2中度3重度46 结果评价6.1 临床观察评价在试验周期内的任意时间点，3只动物中如有1只及以上出现重度红斑、水肿、糜烂或溃疡现象，则可直接判定该受试物为重度口腔黏膜刺激反应，其它情况以下述组织学评价为准。

6.2 组织学评价6.2.1 若1只动物对照侧颊囊组织学评价记分之和大于9时，则考虑认为是试验操作时造成的损伤，有必要进行重复试验6.2.2 试验组平均记分减去对照组平均记分得出刺激指数，并根据表3对口腔黏膜组织反应程度进行分级表3 口腔黏膜组织反应分级刺激指数（X）反应程度0无0＜X≤4极轻4＜X≤8轻度8＜X≤11中度11＜X≤16重度7 结果判定根据临床观察评价进行结果判定，临床观察为重度口腔黏膜刺激反应是不可接受的（见6.1）；依据6.2.2口腔黏膜组织反应分级，认为中度、重度口腔黏膜刺激反应是不可接受的8 试验结果的解释本结果通过评估受试物对口腔黏膜的刺激性，旨在为理解其对人体的潜在影响提供了初步数据鉴于动物与人类生理反应的差异，试验结果外推到人的可靠性有限，必要时建议在适当情况下进行临床验证。