双光子显微镜.doc

双光子显微镜　　双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题：一是标记染料的光漂白现象因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系使用单激发光源，双光子具有相同的波长，该技术被称为双光子激发荧光显微术如果两个光子具有不同的波长，就称作双色激发荧光显微术双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度（两个光子必须在10－18秒内到达）。

双光子吸收截面很小，对若丹明B一般为10－50cm4 s photon－1 molecule－1，这样，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发钛宝石激光器等锁模的，高峰值功率激光可以为双光子激发提供足够的强度由于激发强度随到焦平面的距离的平方变化，在z轴方向双光子激发几率随离焦距离的四次方衰减，荧光团激发只发生在焦点内用数值孔径为1.25的物镜，激发波长为780纳米，全部激发荧光的80%被局限在焦平面1微米范围内，激发体积大约为0.1-1飞升，与传统荧光显微镜相比，该体积降低了1010倍在激光扫描荧光显微术中，双光子激发具有三维层析能力，该三维层析效果可与共焦显微镜相比拟，它还比具有另外两个优势：因为照明光在时间空间上汇聚，没有离焦光漂白；激发光不会被离焦吸收衰减，因而有较大的穿透深度双色激发比双光子激发的优势并不在于较高的分辨率，而是在于小目标物经过较大散射媒质后更容易观察事实上，与双光子激发比较，双色激发在焦点内荧光散射增加，而干扰背景荧光只有很小增加结合多光子荧光技术，多光子共聚焦显微镜（Multiphoton Excitation－MPE）的发展成功的解决了传统共聚焦显微镜（单光子共聚焦显微镜）所存在的问题，MPE的激光源是超快激光器（多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度），具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。

多光子的吸收现象是非线性效应，只发生在聚焦焦点处，不需要共聚焦孔径光阑滤光，从而大大提高成像亮度和信噪比在传统激光共聚焦显微镜中，光通过出的所有样品都被激发，所以必须用孔径光阑来选取焦点处样品发出的荧光孔径光阑不仅遮挡了焦点以外样品发出的荧光，而且也遮挡了焦点处散射和漫反射的荧光在MPE中，焦点处发出的所有荧光，包括散射和漫反射的荧光都可以被收集并探测到并且由于多光子实验所用的激发光的波长较长，激发光的散射损失很小，轴向分辨率更高，样品的穿透能力更强生物分子光子学 转自香山科学会议网 --------------------------------------------------------------------------------香山科学会议第217次学术讨论会综述光子学技术在研究基因表达、蛋白质—蛋白质相互作用、疾病早期诊断、新药研究、药效评价等方面正在或将会发生重要作用随着激光技术、光谱技术、显微技术、计算机技术以及荧光标记技术的飞速发展，结合多个学科，探索光子学技术在生物分子研究及医学诊断与治疗中的应用，已成为国际上迅速发展的领域以“生物分子光子学”为主题的香山科学会议第217次学术讨论会于2003年11月5～7日在武汉华中科技大学举行。

华中科技大学骆清铭教授和武汉大学庞代文教授担任执行主席会议中心议题为：生物分子光学标记技术、生物分子间相互作用的光学成像、生物分子光学成像新技术与三维可视化、在体光学成像等来自全国22家单位的36位专家学者参加了此次学术讨论会骆清铭作了“生物分子光子学”的主题评述报告指出由于光子具有极高的信息容量和效率、极快的响应能力、极强的互连能力与并行能力、极大的存储能力，以及对检测样品的无损伤等优点，光子技术在生命学科中的应用已成为国际上迅速发展的领域蛋白质—蛋白质相互作用是现代生命科学研究的重大科学问题之一，因为这些相互作用不仅控制着基因转录、细胞分裂和细胞增殖，同时还介导细胞坏死过程中的信号转导、致癌转化和调整等传统研究方法虽然取得了非常重要的研究成果，但还不足以解释生命活动的基本规律，因此非常有必要发展一种能对蛋白质—蛋白质相互作用进行在体无损成像的研究方法他还介绍了目前国际同行对动物活体内基因表达与蛋白质—蛋白质相互作用的在体光学成像领域的研究他认为此项研究工作在国际上刚刚开始起步，其主要涉及报告基因标记技术和微型正电子发射断层成像与光学成像检测技术最新的研究表明，采用报告基因的互补与重组策略，可很好地实现动物活体内基因表达与蛋白质—蛋白质相互作用的无损在体光学成像监测。

他还对活细胞内基因表达与分子间相互作用动力学过程的实时在体光学成像的各项技术进行了评述，并对各项技术的可能应用进行了展望一、生物分子光学标记技术王柯敏教授作了“基于生物纳米颗粒和分子信标的荧光识别方法”的中心议题报告他指出，人们对生命现象的观察和研究已深入到单细胞、单分子和核酸的单个碱基这样的层次为了更加准确地研究生物分子间的相互作用以及重大疾病的早期诊断，迫切需要在更加微观的尺度（纳米尺度和单分子水平）上原位、活体、实时地获取各种生物化学信息这对现有许多传统的、常规的分子生物学方法与手段是极大的挑战光学标记技术与光学成像技术在研究基因表达以及蛋白质—蛋白质相互作用的过程中，为获取及利用各种生物化学信息提供了革命性的手段他还指出，合成各种尺寸的荧光纳米颗粒和荧光量子点纳米颗粒，通过表面修饰的方法使其表面具有生物活性与生物靶向性，利用纳米颗粒显著放大信号的优势，将其用于活体细胞和动物器官的基因表达和蛋白质实时在体光学成像研究；建立核酸切割过程、核酸磷酸化过程以及核酸连接过程的荧光监测方法，实现核酸—蛋白质相互作用的实时监测等，可望在生命活动的基本规律研究方面发挥重要作用庞代文教授在“纳米标记”专题发言中，介绍了一种简便、安全、高效、廉价的核/壳型量子点的合成新方法，可大量制备性能优良的CdSe/CdS和CdSe/ZnS等II-VI核/壳型量子点。

该方法操作安全、简便、重复性好、价格低廉，为大规模工业化生产核/壳型量子点奠定了基础他们研制出具有生物分子（或特异细胞）识别（靶向）功能、荧光示踪功能、可操纵功能的多功能生物医用新材料并初步实现了癌细胞的靶向可视化富集抓取；研制出基于纳米金标记放大技术的电化学DNA传感器，提出“多级三维双放大” 概念；研制出基于纳米标记放大技术的目视化基因诊断芯片，实现基因检测的直接目视化等赵元弟教授在“纳米生物光子学”的专题发言中，介绍了国际上一门新兴的交叉学科，即结合纳米技术用于生物体系的光子学研究的纳米生物光子学认为它应包括两个层次的研究，一是在纳米尺度上研究生物问题的光子学，包括纳米分辨光学显微成像技术、及光学纳米操纵与检测技术、以及光学纳米操纵与检测；二是纳米光学技术在生物学中的应用，如荧光共振能量转移(FRET)、分子信标和纳米荧光探针等针对纳米荧光探针，他以量子点为例，按分子、细胞、组织和在体等层次介绍了其在生物分子光子学中的应用，并指出，以量子点的生物功能光学成像研究为代表的纳米生物光子学研究将是其实验室下阶段的主要研究方向黄振立博士在“高通量药物筛选中的光子学技术”专题发言中，介绍了国内外高通量药物筛选的研究现状、高通量药物筛选在创新药物发展中的作用、高通量药物筛选中的各种光子学编码技术以及高通量药物筛选中用于评价药效的光子学方法等。

他指出发展/研制具有我国自主知识产权的、用于高通量药物筛选的光学系统是现阶段我国创新药物开发研究的迫切要求，这一点应受到国内同行的格外重视姚祝军教授在“蛋白质标记和细胞生物学研究”的发言中，指出传统影像学与生物分子影像学的区别在于，一个是“群体和平均行为”，一个是“单个分子和几个分子”水平；一个是“结果”，一个是“过程”；一个是“推测可能的机理”，一个是“清楚认识机理”他指出：生物分子影像学的研究领域包括信号传导、基因转录、代谢运输、细胞生长、蛋白质构象变化与功能调节等；小分子有机物标记具有许多优点，如分子量小，透膜性质好，“可药性”强，结构可以优化，性质稳定、对研究对象干扰小等；小分子标签对蛋白质的体内标记可通过基于自剪接多肽(instein)的对蛋白质的小分子标签、第三者的蛋白质专一性小分子标签、可逆且专一的蛋白质标签和共价键专一且不可逆的小分子标签等四种方式实现讨论中，大家一致认为，光学标记技术是生物分子光子学的重要基础，它在研究基因表达、蛋白质—蛋白质相互作用、疾病早期诊断、新药研究、药效评价等方面正在发生重要作用二、生物分子间相互作用的光学成像新加坡国立大学余严军教授在题为“光学成像技术在组织工程中的应用”的特邀报告中，介绍了光学成像技术在肝组织工程中的实际应用。

指出，由于组织工程体外研究，要求监测手段具有实时，特异性，***，高分辨，定量等特性，因此光学成像技术很适宜此研究余严军教授还介绍了肝组织工程中细胞培养过程中光学成像技术的具体应用，如细胞功能的提升与定量，细胞微环境的调控与定量，细胞种植在棚架中成像问题等邢达教授作了“FRET技术及其在蛋白质—蛋白质相互作用研究中的应用”的中心议题报告他指出，荧光共振能量转移（FRET）具有在体无损伤的特点，能动态地反映活细胞生理事件的时空变化以及细胞信号转导通路的时空传递特性，因此可以在活细胞正常生理条件下无损伤地研究蛋白质—蛋白质间相互作用如检测各种酶活性的变化；观测蛋白－蛋白相互作用；追踪蛋白质在细胞内定位，运动，降解；决定蛋白复合物中两蛋白分子间的构。