抗生素类药物的质量分析方法（一）课件.ppt

抗生素类药物的质量分析方法抗生素类药物的质量分析方法（一）（一） 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素 概况概况l抗生素是指在低浓度下即能杀灭或抑制其他病原抗生素是指在低浓度下即能杀灭或抑制其他病原微生物的药物，按其结构可以分为微生物的药物，按其结构可以分为-内酰胺类、内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类及其他抗生素氨基糖苷四环素类、氨基糖苷类及其他抗生素氨基糖苷类抗生素是由氨基环醇与氨基糖缩合而成的一类类抗生素是由氨基环醇与氨基糖缩合而成的一类多羟基抗生素，是临床上常用的一类广谱抗生素多羟基抗生素，是临床上常用的一类广谱抗生素可通过微生物发酵或半合成而制得目前药典收可通过微生物发酵或半合成而制得目前药典收载的品种主要有：链霉素、卡那霉素、阿米卡星、载的品种主要有：链霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依替米星、庆大霉素、新妥布霉素、奈替米星、依替米星、庆大霉素、新霉素等霉素等结构结构庆大霉素庆大霉素结构结构链霉素链霉素一、药典方法一、药典方法 中国药典中国药典(2000(2000年版年版) )，美国药典，美国药典(25(25版版) )、英国药典、英国药典(2000(2000年版年版) )对氨基糖苷类抗生素的含量测定大多采用微生物法，对氨基糖苷类抗生素的含量测定大多采用微生物法，有关物质的检查大多采用薄层色谱法或反相高效液相色有关物质的检查大多采用薄层色谱法或反相高效液相色谱法。

微生物法作为一种经典的方法，仍被各国药典所谱法微生物法作为一种经典的方法，仍被各国药典所采用本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理设计，比较标准品与供试品两者采用量反应平行线原理设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响因素复杂，微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响因素复杂，操作费时操作费时 以下介绍本组同学查阅的其他方法：以下介绍本组同学查阅的其他方法：一、色谱分析法一、色谱分析法气相色谱法气相色谱法( (GC)GC) 高效液相色谱法高效液相色谱法( (HPLC)HPLC) 离子交换色谱法（离子交换色谱法（IECIEC）薄层色谱法薄层色谱法( (TLC)TLC) 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法( (HPCE)HPCE)气相色谱法(GC) 氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物，且在紫外可见光氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物，且在紫外可见光区无吸收，须先进行衍生化，使其适于分析区无吸收，须先进行衍生化，使其适于分析。

HoebusL等用六甲基二硅烷柱前衍生测定大观霉素，用填充柱气相色谱法，氢火焰离子化检测器检测，在75一125的浓度范围内，呈良好的线性，杂质的定量限为0.1PreuL等选择适当的衍生化试剂，采用毛细管气相色谱气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析氨基糖苷类抗生素也是应用比较广泛的一种联用技术 高效液相色谱法(HPLC) HPLCHPLC测测定定此此类类药药物物含含量量大大多多采采用用反反相相色色谱谱或或离离子子对对色色谱谱系系统统，根根据据检检测测手手段段的的不不同同可可分分为为紫紫外外检检测测、荧荧光光检检测测、电电化化学学检检测测及及质质谱谱检检测测等等柱柱前前衍衍生生反反相相HPLCHPLC是是此此类类药药物物最最为为常常用用的的一一种种测测定定方方法法中中国国药药典典采采用用邻邻苯苯二二甲甲醛醛(0(0PA)PA)柱柱前前衍衍生生化化，紫紫外外检检测测硫硫酸酸庆庆大大霉霉素素C C组组份份同同时时，有有报报道道用用柱柱后后衍衍生生，荧荧光光检检测测食食品品中中的的链链霉霉素素残残留留量量为为了了避避免免使使用用衍衍生生化化试试剂剂，可可以以采采用用灵灵敏敏度度较较高高的的电电化化学学检检测测器器及及采采用用LC-MSLC-MS联联用用技技术术。

LC-MSLC-MS将将HPLCHPLC的的高高分分离离效效能能和和质质谱谱的的高高选选择择性性、高高灵灵敏敏度度及及丰丰富富的的结结构构信信息息相相结合，已成为重要的分离分析方法之一结合，已成为重要的分离分析方法之一离子交换色谱法（离子交换色谱法（IEC）l采用高效阴离子交换色谱分离硫酸庆大霉素、硫采用高效阴离子交换色谱分离硫酸庆大霉素、硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其杂质，然后采用积酸新霉素和硫酸奈替米星及其杂质，然后采用积分脉冲安培检测进行直接测定，不需衍生，简便分脉冲安培检测进行直接测定，不需衍生，简便快速l缺点：检测器的灵敏度对药物中的微量杂质仍显缺点：检测器的灵敏度对药物中的微量杂质仍显不足，体系对有些组分的分离不尽理想，重现性不足，体系对有些组分的分离不尽理想，重现性较差较差l来源：仪器分析网来源：仪器分析网HPLC蒸发光散射检测法蒸发光散射检测法(HPLCELSD) l近年来出现的蒸发光散射检测器近年来出现的蒸发光散射检测器( (ELSD)ELSD)由于其响应值不由于其响应值不依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的样依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，并且物理性质相似的物质其响应因子基品均能被检测，并且物理性质相似的物质其响应因子基本一致，灵敏度是示差折光检测器的本一致，灵敏度是示差折光检测器的2-102-10倍，现已逐渐倍，现已逐渐成为目前常用的通用型检测器。

成为目前常用的通用型检测器在用HPLC-ELSD法测定硫酸小诺霉素(C2b)注射液时发现有些样品含有庆大霉素C1a杂质；在分析庆大霉素C组分时发现有的样品在C2与C2a峰之间有小诺霉素(C2b)杂质峰由此看出，蒸发光散射检测器的应用已为全面分析无紫外吸收的氨基糖苷类抗生素的质量提供了一种新的手段但本法也有一些不足之处，例如灵敏度比紫外检测的低(23个数量级)数据处理相对繁琐薄层色谱法(TLC) lTLCTLC作为一种定性的方法鉴别氨基糖苷类抗生素作为一种定性的方法鉴别氨基糖苷类抗生素已被各国药典广泛采用扫描密度计与已被各国药典广泛采用扫描密度计与TLCTLC技术技术相结合产生的高效薄层色谱法相结合产生的高效薄层色谱法( (HPTLC)HPTLC)因其灵敏因其灵敏度、分离度和准确度都有很大提高，已用于药物度、分离度和准确度都有很大提高，已用于药物定量分析定量分析 TLCTLC具有使用范围广，样品预处理简具有使用范围广，样品预处理简单，优化展开剂的组成方便等优点，随着吸附剂单，优化展开剂的组成方便等优点，随着吸附剂高效化，定量分析仪器化、自动化，高效化，定量分析仪器化、自动化，TLCTLC仍然是仍然是不可替代的一种分析方法。

不可替代的一种分析方法高效毛细管电泳法(HPCE) HPCEHPCE是是一一类类以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道，以以高高压压直直流流电电场场为为驱驱动动力力的的新新型型液液相相色色谱谱分分离离技技术术根根据据分分离离模模式式的的不不同同，又又可可分分为为毛毛细细管管区区带带电电泳泳( (CZE)CZE)、毛毛细细管管等等电电聚聚焦焦( (CIEF)CIEF)、毛毛细细管管凝凝胶胶电电泳泳( (CEC)CEC)，胶胶束束电电动动毛毛细细管管色色谱谱( (MEKC)MEKC)等等氨氨基基糖糖苷苷类类抗抗生生素素的的HPCEHPCE检检测测方方法法，最最为为常常用用的的是是柱柱前前及及柱柱内内衍生的衍生的CZECZE技术，然后进行紫外检测技术，然后进行紫外检测二、免疫法二、免疫法(IA)lIA是是近近年年发发展展起起来来的的一一种种用用于于体体内内药药物物监监测测的的分分析析方方法法，将将分分析析方方法法与与免免疫疫原原理理相相结结合合，进进行行超超微微量量分分析析，具具有有灵灵敏敏度度高高、特特异异性性强强、用用样样少少等等优点l根根据据对对抗抗原原标标记记方方法法不不同同，IA可可分分为为放放射射免免疫疫法法(RIA)，酶酶免免疫疫法法(EIA)，荧荧光光免免疫疫法法(FIA)，化化学学发发光光免免疫疫法法(CLIA)，毛毛细细管管电电泳泳免免疫疫分分析析法法（CEIA)CEIA)和浊度免疫分析法。

和浊度免疫分析法三、三、流动注射法流动注射法(FIA) 流流动动注注射射法法( (FIA)FIA)是是一一种种自自动动分分析析法法，适适用用于于医医院院制制剂剂的的快速检验及中间体质量控制快速检验及中间体质量控制 用用恒恒流流量量泵泵使使硫硫酸酸铁铁铵铵试试剂剂和和载载液液( (水水) )流流过过内内径径为为0.50.5l l mmmm的的四四氟氟乙乙烯烯泵泵管管，与与进进样样口口注注量量的的一一定定浓浓度度硫硫酸酸链链霉霉素素水水溶溶液液在在反反应应圈圈中中混混合合，反反应应呈呈包包，于于520520nmnm处处用用721721分分光光光光计计测测A A，通通过过对对数数转转换换器器，在在记记录录仪仪上上获获得得相相应应的的峰高 硫硫酸酸链链霉霉素素呈呈色色原原理理：硫硫酸酸链链霉霉素素在在NaOHNaOH中中水水解解成成麦麦芽芽酚，与酚，与Fe3+Fe3+呈色，在呈色，在520520nmnm处有最大吸收峰处有最大吸收峰四、络合物光度法四、络合物光度法 l络合物光度法利用金属离子或有机试剂与氨基糖络合物光度法利用金属离子或有机试剂与氨基糖苷类抗生素形成有色络合物，如依文思蓝、曲利苷类抗生素形成有色络合物，如依文思蓝、曲利本红、曲利本蓝、滂胺天蓝等。

应用的方法有本红、曲利本蓝、滂胺天蓝等应用的方法有显显色法、褪色法和双波长叠加法对其进行含量测定色法、褪色法和双波长叠加法对其进行含量测定如依文思蓝所例；如依文思蓝所例；l硫酸新霉素、卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素4种氨基糖苷类抗生素均为饱和烃的取代衍生物，分子结构中只含键和非键电子(n)，而一*，n一* 跃迁需要的能量较高，其吸收光谱带位于远紫外区在200800nm波长范围几乎无吸收依文思蓝(EB)系酸性双偶氮染料，它具有大的共轭体系，在紫外可见光区产生强烈吸收，其最大吸收波长为609nm当上述4种氨基糖昔类抗生素与EB染料反应形成络合物后，其最大吸收波峰视其抗生素不同而分别红移几或几十纳米，吸光度有不同程度的增大，但在染料最大吸收波长附近，即产生褪色反应 苯胺蓝苯胺蓝 在酸性条件下，苯胺蓝的多个磺酸基上的质子离解而以阴离子状态存在，此时卡那霉素则以阳离子形式存在，两者共存时，由于静电引力和电荷转移作用形成复合物使水溶苯胺蓝溶液褪色五、五、脉冲极谱法脉冲极谱法 l原原理理 链链毒毒素素由由链链霉霉胍胍、链链霉霉糖糖和和NN甲甲基基LL葡葡萄萄糖糖胺胺三三部部分分以以糖糖苷苷键键彼彼此此相相连连构构。

链链霉霉胍胍结结构构中中含含有有两两个个C CNHNH，在在滴滴汞汞电电极极上上可可以以发发生生氧氧化化还还原原反反应应产产生生阴阴极极波l实验选用滴汞电极为工作电极，滴汞间隔为实验选用滴汞电极为工作电极，滴汞间隔为1515秒钟，秒钟，Ag-Ag-AgClAgCl电极为参比电极，内装电极为参比电极，内装1.01.0mol/Lmol/L的的KClKCl参比溶液选参比溶液选用微铂电极为辅助电极，以稳定电极电压药物浓度在用微铂电极为辅助电极，以稳定电极电压药物浓度在200700200700u/mlu/ml时，药物浓度与导数峰电流呈线性关系，且时，药物浓度与导数峰电流呈线性关系，且线性关系极为显著线性关系极为显著 六、六、吸附伏安法吸附伏安法lB-R+(CH3)2CHCH0体系中，该类抗生素的吸附伏安行为认为其电极反应过程为化学反应(Schiff碱反应)吸附富集(在-1.35v左右)不可逆还原过程，测得参加反应的电子数为2，氢离子数为1，并导出了反应方程式对不同醛作衍生化剂的情况作比较发现，在阴极扫描过程中，以异丁醛衍生化剂所得的还原峰，比相应的甲醛、乙醛衍生物的还原峰灵敏度高，峰形对称，重现性好。