谈白芍提取物对PMS 肝气郁证大鼠下丘脑Cav1.2介导的CaM-CaMK Ⅱ -BDNF 信号通路的影响.doc

谈白芍提取物对PMS 肝气郁证大鼠下丘脑Cav1.2介导的CaM/CaMK Ⅱ /BDNF 信号通路的影响=“news_bd”> 　　白芍能养肝血，补肝阴，抑肝阳，为促进肝主疏泄调畅情志活动的重要中药之一在现代中医药研究中，常用白芍治疗抑郁白芍提取物是从中提取的，经过精制、浓缩、干燥而成的天然提取物课题组前期研究表明白芍提取物对PMS 肝气郁证模型大鼠有治疗作用CACNA1C 基因编码L 型钙通道(Cav)的α1C 亚基，该亚基是构成功能性钙通道的主要成分，近年来研究表明CACNA1C 基因多态性与情绪类疾病如精神分裂症和重度抑郁发生有关，且与女性的发病更为密切研究者们认为PMS 的发生过程中易感的神经生物学因子与重度抑郁症相似本课题组前期研究表明PMS 肝气郁证大鼠L 型钙通道功能改变那么白芍提取物治疗PMS 肝气郁证与Cav1.2 通道及其下游信号通路关系如何?本研究利用慢性束缚应激方法制备PMS 肝气郁证大鼠模型在整体动物水平检测白芍提取物对PMS 肝气郁证大鼠下丘脑中CACNA1C 蛋白的表达及其介导的CaM/CaMKII 信号的影响在离体细胞水平，检测芍药苷对L 型钙通道(Cav)激活后细胞内钙离子的动态变化影响。

　　1 材料　　1.1 实验动物　　SPF 级健康雌性Wistar 大鼠140-160 g，30 只，由山东中医药大学实验动物中心提供[ 生产许可证号SCXK(鲁)2011-0003]大鼠购买后饲养于行为学实验室一周，置于20±2℃昼夜颠倒的环境，每日21:00 开灯、9:00 关灯除实验期外自由饮食饮水各组大鼠每日均由实验操作者抓握移动，熟悉环境从而消除人为操作的影响　　1.2 实验药品与试剂　　白芍提取物(青岛阳光海川医药科技发展有限公司，批号：20110527);CACNA1C 鼠单克隆一抗(英国Abcam 公司，货号：ab58552);CaM 一抗(美国Sigma 公司，货号：SAB4503194);CaM-PK II 兔多克隆一抗(美国Cell Signaling Technology 公司，批号：4436);p-CaMKII(Thr286)兔多克隆一抗(美国Cell Signaling Technology 公司，批号：3361);BDNF兔单克隆一抗(美国Sigma 公司，货号：AV41970 鼠单克隆一抗);Tubulin 兔单克隆一抗(美国Abmart公司，货号：M2005)。

山羊抗兔二抗(济南远达晶美生物科技有限公司，货号：SB20026619);蛋白Marker(美国Thermo Fisher Scientific 公司，货号：SM0671，批号：26681)，预染蛋白marker(美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号：26619);蛋白酶抑制剂(美国Sigma 公司，货号：P8340)Fluo-4(美国Life Technologies 公司，货号：F1420126619)，Neurobasal 培养基(美国Gibco 公司，货号：21103，批号：10888-022)，B-27@ Supplement(50×)(美国Gibco 公司，货号：17504-044)1.3 实验仪器显微镜(日本OLYMPUS 公司，型号：CX21);大鼠旷场实验箱(北京天鸣宏远科技发展有限公司，型号：XR-XZ301);SDS-PAGE 电泳仪、蛋白印迹转移装置(美国伯乐公司，型号：041BR86548);凝胶成像系统(英国Syngene 公司，型号：G：BOX Chemi XR5)激光共聚焦显微镜(日本ZEISS 公司，型号：LSM510)。

　　2 方法　　2.1 PMS 肝气郁证大鼠模型制备、给药及行为学评价　　选用慢性束缚应激法制备模型采用旷场实验筛选得分相近大鼠进入实验，依阴道涂片镜检法确定大鼠的动情周期根据阴道涂片结果，选择动情周期处于非接受期(动情间期和动情后期)大鼠30 只，标记，称重按随机数字表的方法将大鼠随机分为3 组, 分别为正常对照组(简称正常组)、PMS肝气郁证模型组(简称模型组)、PMS 肝气郁证造模给予白芍提取物组(简称白芍组)白芍组在造模的同时每天上午9:00 灌胃给药一次，每日给药剂量为36 mgkg-1(相当于人临床8 倍剂量)，持续造模过程整个阶段正常组和模型组大鼠给予相同体积的灭菌饮用水造模完成后，即进行旷场实验，计算糖水消耗量以及强迫游泳实验　　2.1.1 旷场实验　　给药结束后，应用XR-XZ301 旷场实验系统，XR-SuPerMaze 动物行为视频跟踪分析系统，进行旷场实验旷场箱尺寸L×W×H=100 cm×100 cm×50 cm(大鼠)，摄像采样速度：15 帧/ 秒;每只大鼠观察时间为6 min，每只大鼠实验结束后使用酒精清洁旷场箱。

　　2.1.2 强迫游泳实验　　将大鼠放入水温23℃、水深30 cm 的透明玻璃桶中(高度：40 cm，直径：20 cm)，同时进行视频采集，15 min 后，将实验动物转移至干燥环境30 min，待大鼠毛发干燥后将其移回鼠笼中，每只大鼠实验结束后清洁圆筒并换水实验结束后使用视频分析软件进行视频分析，记录悬浮不动时间、悬浮不动次数和潜伏期，其中悬浮不动为大鼠身体漂浮于水面身体轻微运动保持鼻孔露出水面进行强迫游泳的同时应用Smart 3.0 行为学视频采集与分析系统采集大鼠行为学数据(悬浮不动时间、悬浮不动次数)，并通过后期观看录像记录大鼠强迫游泳潜伏期　　2.2 脑组织取材　　强迫游泳实验完毕后，将大鼠称重，断头处死，于冰上迅速剥离下丘脑装入1.5 mL 离心管中，立即置于液氮罐中迅速冷冻，后转移入-70℃冰箱备用　　2.3 样品蛋白浓度检测　　取出脑组织，室温解冻，配裂解液(PMSF：RIPA=1：100)，称量组织重量，按照组织重量(mg)：裂解液体积(μL)=1：7.5 比例加入裂解液，用组织匀浆器研磨组织至无组织块4℃ 13 000 rpm 离心10 min，取上清液按照蛋白上清液体积：5×Loading Buffer 体积=1：4 比例加入5×Loading Buffer，混匀后100℃水浴变性5-10 min，-20℃保存。

按照BCA 试剂盒说明书操作计算蛋白浓度　　2.4 Western bolt 法测定下丘脑中相关蛋白的表达　　以40 μg 下丘脑总蛋白每泳道上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿法转移至NC 膜上，将NC 膜室温震荡2 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min分别于相应的一抗(Anti-CACNA1C， 1：500;Anti-CaM，1：800;Anti-CaMK Ⅱ，1：1 000; Anti-p-CaMK Ⅱ，1：1 000;Anti-BDNF，1：1 000;Anti-Tubulin，1：2 000)摇床4℃孵育过夜TBST 洗膜3 次，每次10 min，室温振摇将NC 膜放入二抗稀释液中室温振摇1 hTBST 洗膜3 次，室温振摇10 min 最后用TBS 洗膜1次，室温振摇10 minECL 发光液A 液和B 液等体积避光混匀，配成发光液吸去NC 膜表面的TBS，在目的条带附近滴加发光液，最后使用成像仪成像　　2.5 芍药苷对L 型钙通道激活后细胞内钙离子浓度的影响　　参照课题组之前的SOP 体外培养大鼠海马原代神经元，在培养至第7 天加入芍药苷，干预时间为24 h，细胞分组情况如下：空白组、芍药苷高剂量组(200 μM)、芍药苷中剂量组(100 μM)、芍药苷低剂量组(50 μM)。

用HBSS 清洗细胞3 次，加入Fluo-4 染料1 mL，37℃，孵育45 min洗净Fluo-4染料，并使用HBSS 将细胞外残留的染料洗净，再加入1 mL HBSS，孵育15 min，使细胞内钙离子与染料充分结合曝光时间100 ms，荧光参数为：激发波长488 nm，发射波长530 nm每3 s 收集一次图片，采集240 s，第30 s 向细胞中加入KCl，使其终浓度为100 mM2.6 数据分析利用GraphPad Prism 5 统计软件进行数据分析，数据以x-±s 表示，采用one-way ANOVA 进行分析，P<0.05 认为差异有统计意义　　3 结果　　3.1 PMS 肝气郁证大鼠模型评价　　3.1.1 各组大鼠的宏观行为学表现　　实验前，各组大鼠均精神状态良好活泼好动、毛有光泽、眼角干净、球形粪便第一天束缚时，模型组和给药组大鼠表现为强烈的反抗、嘶叫、双目圆睁、毛须竖立、粪便明显增多;造模结束后，对照组大鼠的状态与初期相同，模型组大鼠不活跃，精神萎靡，毛发散乱直立、眼神呆滞，大便变稀，反抗能力明显降低;解开束缚纱布时，未见对峙，大多跑到角落不动而给药组大鼠在被抓时，叫声较柔和，毛发较整洁，眼角干净，与模型组相比活动明显较多。

　　3.1.2 旷场试验得分以及糖水偏好率　　旷场试验得分是动物探索行为及兴奋性的总体反应，本实验结果造模前各组大鼠旷场试验得分无显著性差别;造模后，与正常组相比，模型组大鼠旷场实验得分显著性降低(P<0.01);白芍组无显著性差异造模前各组大鼠糖水消耗量无显著性差别，造模后，与正常组相比，模型组大鼠糖水偏好率呈极显著性降低(P<0.001)，白芍组大鼠无显著性差别　　3.1.3 强迫游泳实验　　给药后，大鼠非接受期悬浮不动时间结果显示，与对照组相比，模型组显著性升高(P<0.05);与模型组相比，白芍组显著性降低(P<0.01)大鼠悬浮不动次数结果显示，与对照组相比，模型组显著性升高(P<0.01);与模型组相比，白芍组显著降低(P<0.01)　　3.2 各组大鼠下丘脑Cav1.2 介导的CaMK Ⅱ信号通路关键蛋白表达与磷酸化水平　　本实验研究每组样本量为6，主要观察CaMK Ⅱ蛋白表达量及其磷酸化水平，与正常组相比，模型组大鼠下丘脑中CACNA1C 蛋白表达量显著增加(P<0.01)，BDNF 蛋白表达量显著降低(P<0.05)，CaMK Ⅱ 蛋白的磷酸化水平显著增加(P<0.01)，白芍组CaM 蛋白表达量显著降低(P<0.05)。

与模型组相比，白芍组大鼠下丘脑中CACNA1C 蛋白表达量显著降低(P<0.01)，CaM 蛋白表达量显著降低(P<0.01)，BDNF 蛋白表达量显著增高(P<0.01)，CaMK Ⅱ蛋白的磷酸化水平显著降低(P<0.01)　　3.3 芍药苷对海马神经元内钙离子浓度变化　　实验结果显示，加入KCl 后细胞内荧光强度增加，如图5、6 所示与对照组相比，芍药苷各剂量组荧光强度显著降低(P<0.05，P<0.01)，且降低程度与剂量相关　　4 讨论　　本文从体内外两个水平研究了白芍提取物及其主要有效单体芍药苷对PMS 肝气郁证大鼠脑中L 型钙通道(Cav1.2)介导的CaM/CaMK Ⅱ信号通路的作用实验结果表明Cav1.2 介导的CaM/ CaMK Ⅱ在模型组大鼠中关键蛋白CACNA1C 的蛋白表达和CaMK Ⅱ的磷酸化水平是升高的而BNDF 蛋白表达降低;造模同时给予白芍提取物后大鼠下丘脑中上述蛋白无异常表达的现象高浓度KCL 在细胞内可激活L 型钙通道，芍药苷可显著抑制由KCL 引起的细胞内钙超载　　近年的研究认为CACNA1C 是精神情感障碍类疾病的易感基因之一，基因敲除实验表明经基因修饰的CACNA1C-/- 小鼠对二氢吡啶不敏感，硝苯地平对强迫游泳实验的小鼠无抗抑郁作。