高羊茅高频再生体系的建立和基因枪法介导的遗传转化研究高羊茅几丁质酶基因Ⅰ保守片段的克隆及其序列分析.pdf

撼蓑高羊茅( F e s t u c aa r u n d i n a c e 葡，又称苇状羊茅，系采本科( G r a m i n e a e ) 羊茅属植物，原产西欧、j b 菲，窀其有抗旱、耐瘠薄，适斑性广簿特点，在城市绿纯及运动场草坪铺设中瘟建十分广泛蜒出予窀连存在峙只糕糙、没富镯匐茎、爰拳生长缓橙、荔遗瘸瓣体帮聚草侵害等照质上的缺陷，因聪瓣要对其进杼品种泼良邂过转基因技术培蠢出其餐优嶷抗逆性状且夔观的商羊茅晶系近年米备受人们的重视植物j 敷传转化的先决条件是高频再生体系的建立，放本研究首先以高筚茅成熟种子为多} 稽俸、以Ⅺs 为基奉薅养基，研究了商羊茅箍性愈伤组缓诱导和继代、磊生植株分纯和生根等培葵蒸中各级分豹簸逶配魄，建立了建叛再生体系实验续聚表明在鼹援g m ∥L2 ，4 固的M S 培养旗上愈伤组织诱导频率最蕊，初擞愈伤组织在禽育5 m ∥L2 ，4 - D 、4 0 0 m g ／LC B 、6 0 9 ／L 蔗糖和1 2 9 ／L 琼脂的I l S 继代培养基上可诱导出胚性愈伤组织和体细胞胫在禽2 ．O m g ／L6 一B A 和0 ．5 m g ／LN A A 的M S 培养基上分化形成丛生苗，分化颓率达到7 8 ．9 ％。

再生萤在1 ／2 l I S + N A A0 ．辆g ／U 生禳培养基上生撤率达1 0 0 ％蕊对发现在继栈培养基串将蔗糖和璩鼹浓度撮瘫、{ ! 圭及添如一定爨豹c l l 从露形成一个舞渗环境能明显撼囊题性愈伤缎织的矮量和诱导频率，十分有刹于后期的分化，邀是高攀茅高频再生体系形成的一个非常* 键的因素艇因枪技术蝇禾本科植物遗传转化的常用方法，本二c 作利用P D S I O O O ／H e 基因枪将质粒p A R N 6 ( 党隆有水稻J h ] 质酶基因g C 2 4 ) 鞠质粒p D ( 克隆有0 一葡糖醛酸耱苻酶基因占坩鞠选择标记基嚣b a r ) 导入高渗薤理触左套豹离苇茅坯赣愈伤缀织，在分剥辩热2 溉∥L 、3 锄∥L 、5 ．O m g A 除草裁P P T ( 摹l ‘膦) 魄分化壤葵基上黠轰戎楗辩进抒捞度薅选翻培萋，结果在附加2 ．O m g ／L 的P F I ' 培养基上愈伤组织基本上全部生长正常；在附加5 O m g ／kP P T的培养基上愈伤组织几乎全部死亡{ 而在附加3 ．O m g ／LP P T 的培养接上，大部分愈伤组织逐渐变为福色而死亡，少部分能正常生砼。

由此可见．采用3 m g ／L 的P P T 筛选浓度较为台遥经赭逡器生焉荚获褥9 3 拣秀生箍株，；{ = | 含有0 ．2 ％T v e e n - 2 0 豹2 0 0 m ∥LP w 溶液对楗株叶片进行嚷洒，最终从9 3 撼褥生擅檬中臻选出辫株时冀始终- 泰糖荽麴再生莲，经P C R 貉定初步确定为转化植株另外本，l ：作揪据儿种采本科植物j 类J kJ ‘质酶氨基隧序列及其基因核箭酸序列的同I灏性比对结果设计出一对简并引物( P 1 ：5 ’- T G C C C C A A C T G C C T C T G C T 一3 ’、P 2 ：5 ’- c c T 饿G( T ／C ) T G T A G C A G T C ( c ／G ) A 一3 ’) ，通过P C R 艇廊克隆了两条高羊茅几丁质酶基因片段 ● -用0 ．2 ％氯化汞溶液处理幼嫩叶片2 4 h ，提取总R N A ，同时从新鲜幼嫩叶片中提取总D N A ，鼓二囊为摸教分别进行R T - P C R 帮P C R 反应，扩壤嚣褥§《嚣令长度各为8 4 9 b p 秘8 4 3 b p 的D N A 赞段，分捌命名为f e s c u e - 1 及f e s c u e - 2 ：缝六穰秘译后推导出两个遘续完整的氨基酸序列。

分别命名为g y m - p r o - 1 及g y m —p r o - 2 懒j 懒弛i 酊软f 憷行比对，发现这两个推导出的氮基酸序列相似性达到9 9 ％，两个核苷酸序列相似性达到9 7 ％谯N C B I 网站上进行B L A S T 搜索，结果表明它们的核萤酸序列和氨蒸教序列分别和其它j 艮本苇；} 植物的I 类几丁豢薅萋因彦魏蠢蠹薹黧黪期鸯较蹇鹣露漂瞧，其中，g y m —p r o 一1 与翠热蓉、丈麦及黑麦l类几丁质酶的氨基酸序列相似性分别商达8 5 ％、8 7 ％和8 4 9 6 同源性比对结果显豕，两条扩增片段在序列上具有微小差异，遮表明f e s c u e 一1 与f e s c u e - 2 并非来自予同一个基因，即R T - P C R 中扩增产生r e s c u e 一2 的m R N A 势不是P C R 中扩罐产熏f e s c u e 一1 麴攘裁撼A 熬转录产凌本王撵察簸臻莱显示在襄苹蒡中霹藐存在一个{类』L 丁质酶多基因家族，谨们在核营酸序列和氯溅酸序列上具有高度的同源性关键词：高羊茅；高频再嫩体系：微弹轰击{I 类几] 质酶；同= i 玛i 性。

羲A b s t r a c tF e s m c aa r u n d i n a c e a ，w h i c hb e l o n g st ot h ef a m i l yG r a m i n e a e ，o r i g i n a t e di nW e s tE u r o p ea n dN o r t hA f r i c a N o to n l yd o e si tp o s s e s st h ec h a r a c t e r i s t i c s 程d m u g h t - r e s i s t a n c e ,b a r r e n n e s s - t o l e r a n c ea n dh i 蚺a d a p t a b i l i t y , b u ta l s oi tc a l lb eu s e dt ob e a u t i f yu r b a ne n v i r o n m e n ta n dc o v e rp l a y g r o u n d s ．H o w e v e r , s i n c ei ta l s oh a sd i s a d v a n t a g e ss u c ha sc o a r s el e a f , n oc r e e p i n gs t e m 》s l o wg r o w t hi ns u m m e ra n ds e n s i t i v e n e s st oi n s e c ta n dw e e di n v a s i o n fi tn e e d si m p r o v i n gu r g e n t l y w i t hm o d e mb i o t e e h n o l o g y ．I t i s w e l l - k n o w n t h a t t h e e s t a b l i s h m e n t 《瓣醇一f r e q u e n c yr e g e n e r a t i o n s y s t e m i s a k e y f a c t o rt ot r a n s g e n i em a n i p u l a t i o no fp l a n t ．I nt h i ss t u d y , h i g h * f r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e dw j 氇m a t a r es e e d so fF ∞m c aa r u n d i n a c e aa se x p l a n t sa n dM Sm e d i u ma sb a s i cm e d i u ma tf i r s t ．M e a n w h i l e ，t h eo 牟i m i z a t i o no ft h er a t i oo fm e d i u mc o m p o n e n t sw a sp e r f o r m e df o r e m b r y o n i c c a l h t s i n d e c t i o n ，s n b e u i t m e , d i f 艳r e n t i a t i o n a n d r o o t i n g ．I t s h o w e d t h a t M S m e d i u mc o n t a i n i n g9 m g ／L2 舯W a So p t i m a lf o rc a l l u si n d t r e t i o n ．S h o o t sw e r er e g e n e r a t e do nM Sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h5 ．0 m e d L2 , 4 - D ，4 0 0 m g a 。

C H ，6 0 9 ／Ls u c r o s ea n d1 矩，La g a ra n dt h er a t i oo fc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nr e 瓣h e d7 8 R e g e n e r a t e ds h o o t sw e r er o o t e do l lh a l fs t r e n g t hM Sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h0 , 5 m g ／LN A A ．F u r t h e r m o r e ，i tr e v e a l e dt h a th y p e m s m o t i cs u b c u l t u r em e d i u mw i t h 鞋曲c o n c e n t r a t i o n 疆a g a ra n ds u g a r , s u p p l e m e mo fc e r t a i na m o u n to fC H ( e a s e i nh y d n o l y s s t e ) w e r eb e n e f i c i a lt oc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o na n df o r m a t i o no fh i g h - f r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e m ．M i c m p r o j e e t i l eb o m b a r d m e n tt e c h n i q u ei so f t e nu s e di 硅g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fm o n o c o t y l e d o n ．i nt h i ss t u d y , a f t e rp r e c u l t u r a do no s m o t i cm e d i u mf o ra b o u t6 b ，e m b r y o n i cc a l l u s e so fF e s t u c aa r ' ．o t d i n a c e aw 。

Rb o m b a r d e db yP D S l 0 0 0 ／H e ) D N Ad e l i v e r ys y s t e mw i t hp A R N 6c o n t a i n i n gr i c ec h i t l n a s eg e n e ( R C 2 4 ) a n 。