条件性敲除小鼠.docx

条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因l CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术Cre是重组酶（38kDa），可识别 34bp 长的 DNA 序列loxPloxP 两侧各 13bp 构成回文结构，中间 8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性当 DNA 分子上存在两个同向 loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将 loxP 两侧的序列进行连接；当 DNA 分子上存在两个方向相反的 loxP 序列时，Cre 可导致 loxP 之间的序列发生反转l CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被 Cre 重组酶识别的 loxP 序列，这种基因称为 floxed gene带有 floxed 靶基因的小鼠称为 flox 小鼠在这种小鼠中，通常采用 DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的 loxP 位点loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠l CKO敲除何时何地发生？除了 flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。

Cre 工具鼠中，将 Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除范衡宇老师课件）实验时，将 flox 小鼠和 Cre 工具鼠进行交配，最后获得 flox 纯合且 Cre 杂合的小鼠在这类小鼠中，凡是表达 Cre 的细胞，两个 loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除参考资料：南方模式生物官网）l 交配策略Ø 将获得的flox杂合子小鼠（geneflox/+）分成两部分：1. flox/+小鼠与Cre小鼠交配，同时获得flox阳性且Cre阳性小鼠（该小鼠简写为：geneflox/+；Cre+），flox阳性且Cre阴性小鼠（geneflox/+）；2. flox小鼠自交，获得flox纯合（该小鼠简写为：geneflox/flox）和flox杂合小鼠（geneflox/+）Ø 为获得flox纯合且Cre阳性的小鼠，可有两种繁育方法选择：1. 将获得的flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox杂合子小鼠（geneflox/+）交配，最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠（该小鼠简写为：geneflox/flox；Cre+，该小鼠所占后代比例为：1/8）和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠（geneflox/flox，该小鼠所占后代比例为：1/8）；2. 将获得的flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox纯合子小鼠（geneflox/flox）交配，最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠（geneflox/flox；Cre+，该小鼠所占后代比例为：1/4）和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠（geneflox/flox，该小鼠所占后代比例为：1/4）。

Ø 后续实验（实验组：geneflox/flox；Cre+，对照组：实验组：geneflox/flox）为快速获得上述所需小鼠，可将geneflox/flox；Cre+小鼠与geneflox/flox小鼠杂交l 小鼠基因型鉴定Ø 小鼠编号原则Ø Flox小鼠基因型鉴定（用于鉴定flox纯合、杂合和野生型）PCR鉴定引物位置示意图（可选择P1,P2引物对，或P3,P4，P1,P4引物对）Ø 目的基因组织特异性敲除效果验证（1） DNA水平cre活性验证通常是取一小块表达Cre的组织，抽提基因组DNA，通过PCR的方法对flox区域进行扩增，通过flox区域的有无，定性判断Cre是否发挥作用2） RNA水平cre敲除效率验证通常是取一小块表达Cre的组织，抽提RNA，反转录成cDNA后，通过Realtime-PCR的方法，利用Cre作用后的mRNA ，所设计的引物无法扩增出PCR产物的原理，定量判断Cre作用效率3） 蛋白水平cre敲除效率验证目的组织western blot或免疫组化检测原理：表达cre的组织无法检测到目的蛋白Ø 动物组织DNA抽提1) 250ul 裂解液+2.5ul proteinase K(10mg/ml) 直接消化组织，放于55℃恒温热浴过夜2) 加入同体积（250ul）苯酚：氯仿：异戊醇混合物（使用前摇晃瓶身混匀），上下剧烈震荡15s，12000rpm,15min常温离心3) 转移上清于新的EP管（期间可能会吸起白色絮状物，无妨）4) 加入等体积的异丙醇，上下剧烈震荡15s,12000rpm,15min常温离心5) 倒掉上清（也可用真空泵吸，小心底部沉淀），用75%乙醇（400ul），7500rpm, 5min（可多清洗2遍）6) 将管壁内部及管盖上的残留乙醇吸干，沉淀相对较干，根据不同体积加入ddH2O注：因没加RNA酶，可能会残余RNA，A260/280会居于1.9以上，但PCR无妨lysis buffer配制（裂解液）：先加水500ml，再加各种成分，最后定容到1L成分配置（1L）1M Tris 8.0-100x10mL5M Tris 8.0-50x20mL0.5M EDTA-20x50mL10% SDS50mLl 小鼠饲养及繁殖期间遇到的问题Q：小鼠合笼后，很久都不怀孕？A：考虑换雌鼠或雄鼠，重新交配Q：小鼠合笼后，雄鼠和雌鼠比例及年龄选择？A：雄：雌一般1：2或1：3，不要太多雌鼠。

雄鼠至少8w，9-10w更为合适；而雌鼠一般选择6w及以上Q：什么时候分笼？A：大小鼠的哺乳期是20-22d，3周龄可离乳独立生活，因此出生3周后即可将幼鼠与母鼠分开，独立生活视小鼠生长情况，可多哺乳几天有时为避免笼盒中同时存在两胎幼鼠，导致新生的幼鼠被上一胎幼鼠踩踏致死的情况，在19d左右即可将其分笼分笼时需要标记新生小鼠，选择减脚趾，或打耳钉（耳钉一定要订的足够好，否则后续会被小鼠抓掉）雌鼠4周龄阴腔开张，雄鼠5周龄睾丸降落至阴囊，开始形成精子因此，4周龄前一定要进行分笼，以免发生交配Q：母鼠吃仔怎么办？A：1. 雌鼠与雄鼠合笼交配后，雄鼠可以一直与孕鼠一起生活，这样有利于孕鼠整个妊娠过程的稳定以及仔鼠的出生与哺乳2. 怀孕的雌鼠（一般两只）一起生活，或将怀孕及未怀孕的雌鼠在一起然而，绝对不要在雌鼠分娩前几天再在笼舍中加入新的雌鼠，这样会打扰到孕鼠以及新生仔鼠；要等仔鼠断奶（21天）后才能再将雄鼠放入繁殖笼内3. 第一胎分娩或太过于年轻的新手母鼠育成仔鼠的成功率比有经验或较为年长的雌鼠要低仔鼠出生第一天尽量不要打扰母鼠与幼仔，到第二天母鼠就比较能容忍被打扰的状况了4. 若一直持续吃鼠，选择换孕鼠。

Q：如何准确知道小鼠怀孕天数？A：傍晚5-6点将雌鼠雄鼠合笼，第二天早晨8点检查雌鼠是否有阴道栓（下图所示）有阴道栓的当天中午算为胚胎第0.5天检栓后，未见到栓的雌雄鼠分开，至下午再进行合笼不过，观察到阴道栓只能说明发生了交配行为，并不能完全作为怀孕的标志，见到栓以后仍可能发生未怀孕的情况小鼠表型观测参考点：体型差异、毛发、体重、活动能力，最关键还是要结合敲除或敲入基因的具体功能常见的肝癌模型1. 诱发性肝癌模型：DEN, DEN+CCl4，HFD+CD+CCl42. 移植性肝癌模型：异位移植即皮下成瘤，原位移植（肝脏，经脾脏）3. 基因敲除鼠（如HBV-TG, PTEN, APC, miR-122肝特异性敲除, Myc肝特异性过表达）4. 高压尾静脉HTVI诱发性肝癌模型Treatment( Intraperitoneal injection)Mouse strainAgePost-Intrasplenic inoculation(#tumor/# total mice)20mg/kg DENC57BL-male12day8month-8.5month 20mg/kg DENC57BL-female12day9month-10month l DENl DEN+CCl420mg/kg DEN, injected at day 12 of C57BL mice.1ul/g of 20% of CCL4 (diluted by Olive), start from week 4 of mice, once a week, for 14-18 weeks (Male-16week, female-17week)移植性肝癌模型l 皮下成瘤subcutaneous tumor formation注意点（1） 肿瘤细胞系选择（2） 小鼠品系选择：Nude, NOD/SCID, NSG（3） 接种部位：腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部（血管丰富且易操作部位）操作步骤（1） 肿瘤细胞的传代扩增确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态（病毒感染可选择再传代扩增；若siRNA或质粒转染处理细胞不建议传代扩增，质粒转染24小时，保证最大效率。

siRNA取决于平时做实验的经验2）计算细胞接种量结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到1000万/0.1ml，不可再高（因为细胞悬液已达饱和状态）并且提前计算确定细胞数量，一般注射40只小鼠，至少需要准备50只小鼠的细胞量3）准备裸鼠一般选择5-6W裸鼠，小于4W动物可能不耐受而过早死亡，大于6W免疫力会增强，不易成瘤；雌雄均可（4）操作步骤① 预准备：matrigel 4℃过夜融化，若1人操作可选择使用呼吸麻醉仪，去鼠房前可考虑打一盒冰和带上移液器和枪头，用注射器不好重悬细胞② 接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置（实验室选择以后腿股）；③ 向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；④ 针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为100-200μL（PBS或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤），可看见明显的鼓包；⑤ 接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；⑥ 注射完毕后，缓慢旋转退出针头（Z字型扭），尽量避免漏液；⑦ 细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般2h之内不会有问题。

5）后续实验安排① 分组：一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们一般分为对照组，阳性药物组，低剂量、中剂量及高剂量药物组等；② 数量：荷瘤时每组不少于10只，考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，最终实验应至少可以获取6个有效数据；③ 给药时间：一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起，便可分组实验（鼠源细胞系会更快）；④ 人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，平均肿瘤直径不超过20mm，并且如果出现。