第3章 微生物的基因操作技术(下).pdf

第三章微生物的基因操作技术3.1 基因定点突变(site-directedmutagenesis). 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等图1-1寡核苷酸介导的DNA突变技术 目前，主要采用两种PCR方法， 重叠延伸技术 大引物诱变法， 在基因序列中进行定点突变图1-2重叠延伸介导的定点诱变大引物诱变法示意图PCR介导的定点突变方法的优势 1.突变体回收率高 2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变 3.可在同一试管中完成所有反应 4.快速简便3.2基因敲除技术 3.2.1基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。

 基因敲除分为 完全基因敲除：是指通过同源重组法完全 消除细胞或者动物个体中的靶基因活性 条件型基因敲除：（又称不完全基因敲 除），是指通过定位重组系统实现特 定时间和空间的基因敲除 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛1. 完全基因敲除图6-9用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验图6-10正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞 由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，得用多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系 ①构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点 ②需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因2. 条件型基因敲除的ES细胞杂交，Cre可把两个LoxP位点间的DNA片段切除，导致靶基因失活。

也可用Cre表达质粒转染中靶ES细胞，通过重组将两个LoxP位点间序列删除（包括neo基因）利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理3.3蛋白质及RNA相互作用技术 3.3.1酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription-activating domain,AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达酵母单杂交的基本原理示意图图6-16从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图3.3.2酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。

 BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能图6-17酵母双杂交技术原理示意图3.3.3体外蛋白质相互作用技术 1、Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA图6-18 FarWestern印迹试验2、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白图6-19 GST融合蛋白沉降技术流程3、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点4、等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变图6-21等离子表面共振技术示意图5、免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。

靶蛋白抗体固体基质待筛选蛋白低离心力沉淀或微膜过滤亲和反应反应体系靶蛋白抗体 待筛选蛋白相互作用沉淀得到待筛选蛋白图6-22 免疫共沉淀示意图3.3.4细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： （1）给体与受体在合适的距离（1～10nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件） FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对常用的探针有： 荧光蛋白 传统有机染料 镧系染料 荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体 传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等 镧系染料，金属染料一般与有机染料联用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比图6-23荧光共振能量转移法3.4基因芯片及数据分析 基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。

3.4.1 基因芯片技术原理 把大量已知或未知序列的DNA片段点在尼龙膜或玻璃片上，再经过物理吸附作用达到固定化也可以直接在玻璃板或金属表面进行化学合成，得到寡聚核苷酸芯片将芯片与待研究的cDNA或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到成千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式6-25基因芯片技术流程图1.简易基因芯片 使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固定化也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达调控情况 简易芯片一般基因数量少（一般不超过2000），主要用于研究小部分特定基因的表达状态可用手工制作或者机械手点样图6-26包含280个棉花cDNA的简易芯片的杂交图谱2.大规模基因芯片 通常涉及基因组规模与数量（一般大于10000个基因），分别采用接触式点样，非接触式点样或者半导体技术制备样品 基因芯片的工作流程：（1）经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段。

2）用机械手将PCR产物点在玻璃板上，变性，固定3）分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成cDNA4）用不同的荧光染料标记不同器官或组织的cDNA5）将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交6）激光扫描芯片杂交结果，计算机处理7）分析芯片杂交数据大规模基因芯片的应用3.微珠芯片技术 在包含50000根光纤的直径为3.5mm光纤束中，每根光纤顶部蚀刻出的小洞可镶嵌3μm的微磁珠，每个微磁珠上可据要求连接不同的配体配体可与荧光标记的配体发生相互作用，发生的信号被激发后通过光纤传递到检测器 微珠芯片的优势： （1）密度高 （2）测试重复性好 （3）定制方便 微珠芯片的用途： （1）SNP及基因型分析 （2）基因表达谱分析 （3）蛋白组学研究3.4.3 基因芯片数据分析 数据可靠性分析 生物学意义分析 1.数据可靠性分析 通过两次平行杂交反应，将每个基因在两个反应中的表达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结果都在45º斜线附近，就说明实验结果是可靠的 多个持家基因作为内对照，持家基因的反应信号在两种组织中不变，可确定其他基因表达信号的相对值 2.生物学意义分析 主要指通过分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义。

 将差异表达定位于不同的生物化学代谢途径，研究基因芯片数据中可能具有生物学意义的代谢途径 3.5其它分子生物学技术 1凝胶滞缓实验 凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobilit shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了方法：同位素标记待测的DNA片段细胞提取物DNA-蛋白质复合物探针DNA温育PAGE电泳放射自显影进行DNA凝胶分析拟南芥转录因子与不同DNA元件有不同的结合能力2噬菌体展示技术 噬菌体是细菌病毒的总称，英文为Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，有“吞噬”之意噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。

 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体 噬菌体展示技术的基本原理是将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质图6-36噬菌体展示技术研。