人类锌指蛋白新基因ZNF328的克隆与功能研究.pdf

软件分析统计Z N F 3 2 8 稳定转染细胞二维图谱的蛋白 质点， 并与转染空载体的细胞蛋白 质点比 较， 结果表明该基因的稳定表达可导致H e l a细胞的蛋白 质表达谱的改变综合该基因的结构和表达特征，我们初步得出结论认为:Z N F 3 2 8 基因是参与多种人类胚胎器官发生的锌指转录调控因子我们还研究了另外一个人类锌指蛋白家族新成员 Z N F 3 8 2的功能， 将其开放阅读框克隆至p R S E T C及p E G F P - N 1 表达载体中诱导表达并用纯化的融合蛋白免疫家兔得到抗 Z N F 3 8 2的抗体 W e s t e r n b l o t 结果显示这种抗体能特异地识别在原核表达系统内表达的抗原，并对人类胚胎组织中的 Z N F 3 8 2具有较高的特异性关健词:转录抑制因子，M A P K信号途径，S R E , A P - 1 ，器官发育，w e s t e r n b l o tAb s t r a c tT h e z i n c f i n g e r p r o t e i n s c o n t a i n i n g t h e K r u p p e l - a s s o c i a t e d b o xd o m a i n ( K R A B - Z F P s ) a r e t h e l a r g e s t c l a s s o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i nh u ma nMa n y o f t h e K R A B - Z F P s h a v e b e e n f o u n d t o b ei n v o l v e d i n c a r d i a c d e v e l o p m e n t o r c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s . I n t h i s s t u d y ,w e h a v e i d e n t i f i e d a n o v e l h u m a n K R A B z i n c f i n g e r g e n e , n a m e dZ N F 3 2 8 , fr o m a h u m a n f e t a l h e a rt c D N A l i b r a r y . T h es e q u e n c eo f Z N F 3 2 8 c D N A c o n t a i n s a 2 3 7 6 - b p o p e n re a d i n g fr a m e ( O R F ) a n de n c o d e s a 7 9 2 a m i n o a c i d p r o t e i n w i t h a nKRAB d o ma i n a n dc l a s s i c a l z i n c f i n g e r C 2 H Z m o t i f s i n t h e C - t e r m i n u s . T h e g e n e c o n s i s t s o f8 e x o n s , i n w h i c h E x o n s 6 a n d 7 e n c o d e t h e K R A B d o ma i n A a n d B ,r e s p e c t i v e l y . Z N F 3 2 8 i s l o c a t e d i n1 9 g 1 3 . 4 ,g e n o m i c D N A o f a p p r o x i m a t e l y 2 8 k b . Z N F 3 2 8 i se d i n mo s t o ft h e h u m a n t i s s u e s a n a l y z e d i n d i ff e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , s u g g e s t i n ga p o t e n t i a l r o l e o f t h i s g e n e i n h u m a n e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t a n d r e l a t e dd i s e a s e s . I n t h e C OS - 7p r o t e i n i si n n u c l e u s .i s a t r a n s c r i p t i o nr w h e n f u s e d t o G a l - 4 D N A - b i n d i n gd o m a i n a n d c o t r a n s f e c t e d w i t h V P - 1 6 , K R A B m o t i f i s a p o t e n t r e p r e s s i o nd o m a i n . O v e r e x p r e s s i o ni n C OS - 7 c e ll s i n h i b i t s t h et r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t i e s o f S R E a n d A P - 1 , s u g g e s t i n g t h a t t h ep r o t e i n m a y a c t a s a t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r i n m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ( M A P K ) s i g n a l i n gt o me d i a t e c e l l u l a r f u n c t i o n s . I n o r d e rvt o s t u d y t h e e ff e c t Z N F 3 2 8 g e n e i n H e L a c e l l l i n e , t h e r e c o m b i n a n te x p r e s s i o n p l a s m i d o f p C M V T a g 2 B - Z N F 3 2 8 w a s c o n s t r u c t e d a n di n t r o d u c e d i n t o H e L a c e l l l i n e b y l i p o f e c t i n t r a n s f e c t i o n . Z N F 3 2 8 s t a b l eo v e r e x p r e s s i o n H e L a ce ll l i n e w a s e s t a b l i s h e d a n d c o n f i r m e d b y R T P C R .T o t a l p r o t e i n s w e r e e x t r a c t e d f r o m t h e s t a b l e ce l l l i n e a n d w e r e s e p a r a t e d .T h e 2 D g e l s m a p s o f cell l i n e w e r e s c a n n e d a n d a n a l y z e d c o m p a r a e d w i t ht h e i r c o n t r o l r e s p e c t i v e l y . S o m e u p - r e g u l a t e d a n d d o w n r e g u l a t e d p r o t e i ns p o t s w e r e d e t e c t e d i n s t a b l e t r a n s e c t e d cel l l i n e .A n d i n o r d e r t o s t u d y t h e f u n c t i o n o f Z N F 3 8 2， a n o v e l m e m b e r o fz i n c p r o t e i n f a m i l y , t h e O R F w a s s u b c l o n e d i n t o t w o f u s i o n e x p r e s sv e c t o r s , p R S E T C a n d p E G F P - N l . A f t e r e x p r e s s i n g , t h e f u s i o n p r o t e i n sw e r e p u r i fi e d a n d u s e d t or a b b i t s . T h e r e s u l t s h o ws t h ea n t i b o d y a g a i n s t Z N F 3 8 2 h a s a g o o d s p e c i f i c i t y t o Z N F 3 8 2 i n h u m a ne m b r y o b y W e s t e r n b l o t a n a l y s i s .K e y w o r d s : Z N F 3 2 8 , t r a n s c r i p t i o n a l s u p p r e s s o r , M A P K s i g n a l i n gp a t h w a y , S R E , A P - 1 , o r g a n d e v e l o p m e n t , w e s t e r n b l o tBS AEB吩FCS珊哪PCRHUGO英 文 缩 写 词 简 表牛血清白蛋白基因数据库D u l b e c c o ' s M o d i fi e d E a g l e ' s s o d i u m D u l b e c c o改良培养基二乙 基焦碳酸盐 ( d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e )二甲 基亚 讽( D i m e t h y l S u l f o x i d e )增 强 型 绿色 荧光 蛋白 ( E n h a n c e d gr e e n fl u o r e s c e n tp r o t e i n ) 乙二胺四乙酸二钠 ( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d )澳化乙 锭( E t h i d i u m B r o m i d e )表达 序列标记 ( E x p r e s s e d S e q u e n c e T a g g e d )胎牛血清 ( f e t a l c a l f s e r u m , )人类基因组计划( H u m a n g e n o m e p r o j e c t )开 放阅 读 框( O p e n r e a d i n g f r a m e )聚合酶链式反 应( P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n )十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳( S D S - P o l y A c ry l a m i d e G e l E l e c t r o p h o 。