酵母实验操作方案.doc

酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量 DNA 纯化试剂盒抽提 9KSF2，可得到较纯的质粒 10 μ g/3ml菌液，终体积 80ul 2）线性化质粒使用 80μl酶切体系9KSF2质粒70 μ l内切酶（SacI ，SalI ，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μ l3）酶切3－ 16小时，一般3 小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1） 2 倍体积无水乙醇和0.1 倍体积的3M NaAC （PH 5.2 ），混匀，沉淀DNA；2）－ 20℃数个小时（>2小时），13,200rpm离心10 ～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10 分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA 的离心管另一侧吸取）；4） 37℃烘干水分和残留乙醇；5）用 20 μ l ddH2O 重溶；6） 1ul 样品电泳检测 DNA 量，计算 DNA 总量；三．电转化1．准备感受态细胞1） 5ml YPD 接种 GS115 单菌落， 250rpm ，30℃，摇菌 24 hours ；2） 100ml YPD ，接种百分之一，同时留 1ml 空白 YPD，30 ℃ ， 250rpm ， 7～8 hours ，直到 OD600 ＝ 1.3 ～ 1.5 ；3）菌液转入 500ml 离心管， JA14 ， 1500g ，4℃离心 5 min ，弃上清；4） 100ml 冰水重悬，同上离心，弃上清；5） 80～ 90ml 冰水重悬【 50ml 】，同上离心，弃上清；6） 20ml 冰 1M sorbitol 重悬【 5ml 】，然后转移到 50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约 150 μ l 1M sorbitol重悬【 250ul 】， 4℃备用，剩下的感受态细胞可以保存在－ 70℃冰箱大约 3 周。

2．转化1)100 μ l GS115感受态细胞加入＋ 20 μ 线l性化质粒，用枪打匀；2) 冰浴 5min ，加入 0.2cm 转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V电容25 μ F电阻200 欧姆，放电时间4～ 5ms4) 立即加650 μ 冰l1M sorbitol入转化杯，打匀；5) 迅速涂板， 250 μ 块l/ MD 板，共 3 块；6) 涂好的板放在 30℃培养箱中培养 4～5 天，至菌落直径 1mm 即可注：a）【】内为手册推荐量，相关文献报道，转化效率一般为103～104/ ugDNA ，所需质粒量0.3 －10ug 不等；b）放电是可好出现电击穿现象，原因有：酵母浓度不够；DNA 溶液离子浓度过大；混合液体积不够；c） MD 板加入 1M sorbitol ，转化时第2）步冰浴时间延长至1 － 2 小时，均有利于提高转化效率四． G418 筛选多拷贝基因1）取出长有克隆的 3 块板，可考虑先挑10－ 20 个菌落先表达；2）第一块加入 2ml 灭菌的 ddH 2 O，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块；3）第二块加入 1ml ，洗之，吸入第三块；4）菌液吸入 EP 管，可适量补充 ddH2o ；5）混匀后取适量稀释约 50 倍，4ul ×50＝ 200ul 每块 G418 板，G418 浓度从 0.25 － 4.0mg/ml 各一块；6）注意涂布均匀，可适量补充 ddH 2 O，7） 30℃烘箱培养， 2－ 5day ，其余菌液可 4℃保存注：a）手册推荐方法：第 4）步将菌液转入 EP 管中，振荡 5－ 10 秒，用分光光度计测菌体密度， 1OD 600 ＝ 5×107 cells/ml, 取一定体积稀释至 200ul/ 每块 G418 板, 涂布～ 105 cells ；注意 agar 的存在会干扰分光光度计的读数。

五．表达：1）从G418板挑单克隆入4ml/管MGY 接种，30 ℃， 250rpm， 2天左右至OD＝2－ 6，颜色乳白；2）取 1ml 菌液于 EP 管中保种，余 3ml 菌液离心， 1500g ， 5min ，菌体换 3ml BMMY ，加千分之五甲醇， 300ul/ 管；3）每隔 24 小时加千分之五甲醇；4）至表达之日起 2 天后每天取样 80ul ，留作电泳分析；5）表达4 天结束，1500g离心， 5min ，分别收集上清和沉淀；6）上清用作蛋白分析， 跑SDS-PAGE 电泳， Western Blotting分析， ELISA 分析， 样品浓缩，纯化分析等附录一培养基LB ：Tryptone10g1%Yeast Extract5g0.5%NaCl5g0.5%【 Agar 】15g1.5% （固体培养基另加）dH2O 稀释至 1L ，高压灭菌YPD ：Yeast Extract10g1%Peptone20g2%【 Arga 】20g2 ％（固体培养基另加）dH2O 900ml高压灭菌，冷却至60 度，加10 ×Dextrose100mlYPD － G418 ：250ml YPD 加 10 ×Dextrose 后加适量 G418，注意轻摇混匀，不要产生气泡，同时留空白对照板。

终浓度（ mg/ml ）1.02.03.04.0G418 储液体积（ ml）2.55.07.510.0MD ：YNB3.4g0.34%【 Sorbitol 】 182.2g1M【 Agar 】15-20g1.5%-2%dH2O 800ml高压灭菌，冷却至60度，加10 ×(NH 4) 2SO4100ml1%500 ×biotin2ml－5％4 ×1010 ×Dextrose100ml1％MGY ：YNB3.4g0.34%dH2O800ml高压灭菌，冷却至60度，加10 ×(NH) SO100ml1%42410 ×Glycerol100ml1%500 ×biotin2ml－5％4 ×10BMMY ：Yeast Extract10g1%Peptone20g2%YNB3.4g0.34%K2 HPO43.013gKH2PO411.813g (PH6.0 缓冲液 )dH2O900ml高压灭菌，冷却至60度，加10 ×(NH 4) 2SO4100ml1%每次使用之前，分装后加2/1000体积 500×biotin 2ml 4×10 －5％连接产物的质粒转化1）－ 70℃取出Top10感受态细胞，50ul/管，取出后迅速分装城10ul或 20ul/ 管；2）冰浴30min；3） 42℃， 30秒（精确计时），置于冰水1－ 2min ；4）加等体积37℃预热的SOC 培养基；5） 37℃， 225rpm ，培养 45min ；6） 100ul 分别涂板， 37℃培养；。