利用重组酵母菌生产人胰岛素.docx

利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因f构建重组质粒 f构建基因工程菌f工程菌发酵f产物分离纯化f产品检验其中前三个流程为 产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码 子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9 质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转 化法导入毕赤酵母GS115菌株，经过营养筛选和PCR复筛，得到含人胰岛素基因 的毕赤酵母工程菌株后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批 发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素纯化后的重组人胰岛素产品经 SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的 人胰岛素关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定Using recombinant yeast to produce human insulinHuSheng 1142043040Abstract： The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose gene—construct the recombinant plasmid—construct the genetic engineering bacteria—fermentation of engineering bacterium—separation and purification of the product —identification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay) Keywords： recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。

最初的重组表达是通 过大肠杆菌分别表达出胰岛素的A链和B链现在，胰岛素作为重组蛋白产品， 主要有两条途径获得一条途径是在大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体，通过 溶解和复性等过程获得胰岛素另外一条途径是通过酵母表达系统，分泌表达可 溶性的胰岛素前体进入培养液由于对酿酒酵母大规模培养有丰富的经验，使其 成为了第一个分泌表达胰岛素前体的酵母系统虽然酿酒酵母仍然是主要的胰岛 素产品表达系统，近些年几个备选的表达系统也提供了可能性其中，毕赤酵母 是一种非常有用并且优势明显的表达宿主尤其是它强有力的醇氧化酶启动子， 受甲醇严格诱导调控，通过简单培养可以达到较高的细胞密度，能够稳定且高水 平表达外源蛋白利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因f构建重组质粒f 构建基因工程菌f工程菌发酵f产物分离纯化f产品检验其中前三个流程为产 人胰岛素酵母工程菌的构建；后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产本报告将 从两个方面来介绍，如何利用重组酵母菌生成人胰岛素胰岛素大规模发酵生产产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建1材料和方法1.1材料1.1.1菌种和质粒E. coli DH5a、Pichia pastoris GS115、pPIC9购自 Invitrogen公司；pMD18-T购 自TaKaRa公司。

1.1.2试剂和酶限制性内切酶、T4DNA连接酶、5,磷酸化酶、Klenow大片段及去磷酸化酶均 购自TaKaRa公司；pfuDNA聚合酶、Taq-plus、胰蛋白酶和羧肽酶B购自上海生 工生物工程有限公司；PCR回收试剂盒购自TaKaRa公司；四个片段基因均委托 上海博亚生物技术公司合成；其它常规生化试剂均购自国内有关公司1.2方法1. 2. 1胰岛素基因的克隆参考159种在酵母中表达的蛋白，每种氨基酸均选择酵母中高频使用的密码 子，将人胰岛素基因设计为两两末端互补的四个片段分别进行化学合成，经变性、 退火以及Klenow I补平，获得完整的胰岛素基因片段用于酶促合成胰岛素基因 的四个片段长度都为59 bp：Frgl:5'-AGCGGATCCATGTTCGTTAATCAACACTTGTGTGGTTCTCACTT GGTTGAGGCTTTGTA-3'Frg2:5'-CTAGTCTTTGGAGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACCACAAACCA A GTACAAA GCCTCAAC-3Frg3:5'-ACTCCAAAGACTAGAAGAGGTTCTAGAAAGGGTATCGTTGAACAATGTTGTACTTCTAT-3Frg4:5'-GCCGTCGACTTAATTACAGTAATTTTCCAATTGGTACAAAGAAC A TA TA GAA GTACAAC-3上述四个片段中：Frgl的5'和Frg2的3'含有15个互补碱基；Frg2的5'和Frg3的3, 含有14个互补碱基；Frg3的5'和Frg4的3'含有14个互补碱基。

将四个片段等量混 合，经过高温变性和迅速退火后，四个片段通过互补碱基进行配对，由于Frg2和 Frg3的5',经过了磷酸化处理，在Klenow聚合酶的作用下，缺口处从3'向5'进行 延伸合成完整的人胰岛素基因用聚丙烯酰胺凝胶回收195〜196bp的片段，克隆至到pMDl8-T载体，转化E. coli DH5a,进行方向鉴定后，委托上海生工生物工程有限公司测序根据测序结果， 判断酶促合成的胰岛素基因是否已经正确克隆到pMDl8-T的EcoRV多克隆位点， 基因碱基序列是否与原设计序列完全吻合所克隆的胰岛素基因命名为ins319, 此载体命名为pMINS3191. 2. 2毕赤酵母表达载体的构建和转化1. 2. 2.1表达载体pPINS319的构建：根据pPIC质粒多克隆位点的序列特点，为确 保表达产物经信号肽酶切割后产生精确的胰岛素蛋白N末端，并能直接进行定向 克隆，重新设计上游和下游引物，在上游引物5'端添加pPIC9质粒XhoI位点处的 12个碱基（包括XhoI位点和编码信号肽酶识别位点两个氨基酸的序列，5'-CTCGA GAAAAGATTCGTTAATCAACACTT3'，下游引 物添加 EcoRI 位点（5'-GAA TTCCCGTCGACTTAA TTACA-3'。

以此引物和pMINS319质粒为模板进行PCR 扩增，SDS2PAGE电泳回收扩增的胰岛素基因片段，将该片段和质粒pPIC9分别 用X hoI和EcoR I酶切，电泳回收大片段；将酶切的基因片段与pPIC9大片段混合， 用T4连接酶连接，构建成毕赤酵母表达载体pPIN3191. 2. 2.2表达载体pPINS319的酶切鉴定：为确证胰岛素基因克隆到了pPIC9上， 采用X hoI和EcoRI双酶切鉴定pPINS319,并利用琼脂糖凝胶电泳（2 %琼脂糖凝胶） 检测，若泳道出现一条9.2 kb和200 bp左右的电泳条带，表明重组质粒pPINS319 含有所预期的基因片段1. 2. 2.3毕赤酵母电击转化及转化子检测：重组质粒pPIN319用BglII酶切使之线 性化，然后用电击法转化毕赤酵母菌株GSll5感受态细胞在MD培养基上培养两 天后，长出大约200个转化子挑取20个转化子接种在MM培养基上，有11个转 化子在以甲醇做为唯一碳源的MM培养基上能够缓慢生长（Huts型）为确证胰岛 素基因已整合到毕赤酵母菌株GSll5染色体上，分别提取11个经过初步筛选的阳 性转化子的基因组DNA，并以之为模板进行PCR鉴定。

阳性转化子的PCR鉴定结 果（2%琼脂糖凝胶）胰岛素大规模发酵生产1菌体培养1.1摇瓶培养方法温度30°C，摇床转速230r/min，摇瓶装液量30mL/300mL三角瓶1.2分批补料发酵方法1.2.1种子液制备从新鲜YPD平板上挑取单菌落,接入含BMGY培养基50mL/300mL的摇瓶， 30°C、230r/min下培养20h，作为一级种子再以10%的接种量接入BMGY培 养基50mL （10瓶），同样条件下培养18h,至OD600为20左右，作为发酵罐种 子液1.2.2分批补料发酵培养在12.8L全自动发酵罐中进行，发酵罐中装入改良BSM培养基6L,按 8%接种，培养过程中通气量不小于10L/m in,通过改变搅拌转速保持溶氧水平 不低于30%，用氨水调节pH至6.6菌种生长初期DO较高，随着茵体的生长, 耗氧量增加，DO不断下降待DO降到30以下时，提高转速，当搅拌速率达 到800r/min,解除溶氧搅拌关联当DO陡然上升（表明甘油已经耗尽，耗时约 16h）,开始补加50%甘油（含12mL/LPTMl），并控制流加速度维持DO在30% -40%，当发酵液的OD600至300左右时，开始加入甲醇（含12mL/LPTMl）诱 导，甲醇补加速率由低到高，甘油补加速率逐渐降低最后停止，该过度阶段约维 持4-6h。

根据溶氧的变化及尾气分析仪检测到的C02变化情况及时调整甲醇 和氮源补加速率，适时放罐2人胰岛素前体的纯化与后加工超滤系统简介：由氮气钢瓶、超滤杯、超滤膜组成本系统工作压力0.2MP 左右（不要超过0.3MP）；膜使用前要进行预处理，使用后要清洗膜的预处理：对于新的膜直接用去离子水浸泡半小时后即可使用使用过的 膜应用0.1%的氢氧化钠溶液浸泡，再用去离子水浸泡半小时，冲洗至pH值呈中 性，即可使用膜的清洗与保存：膜使用后立即。