瓷珠菌种保存法.docx

Word文档瓷珠菌种保存法 传统的菌种保存方式简介 斜面保存法：微生物保存最基本的方法，可广泛用于细菌、真菌等，保存期限特别短，斜面简单干裂 液体石蜡保存法：可用于保存霉菌、酵母菌、放线菌及需氧菌，方法简便，可防止斜面干燥和氧气进入，但一些固氮菌、分枝杆菌、毛霉、厌氧菌等不相宜用此法 甘油冷冻保存法：用于一般细菌的保存，需使甘油终浓度为20%左右，然后-20℃或-70℃以下保存溶化时需要水浴溶化 真空冷冻保存法：具有低温、干燥、无氧的保存条件，适用于98%以上菌种的保存，但操作简单，一般试验室难以使用 液氮保存法：基本全部微生物均可保存，并且保存时间长，但操作较为简单而且需要设备，不适用于一般试验室保存菌种 沙土保存法 半固体保存法 瓷珠菌种保存法的原理 瓷珠菌种保存管是试验室保存菌种的容器，管内有表面凹孔小瓷珠用于细菌的吸附和保存，放置于-20℃或-80℃下便可制造干燥、低温、缺养分的环境，使菌株处于"休眠' 状态，方可长期保存（视不同菌种与保存温度，一般可保存3-10 年）, 同时菌种保存管的取用和保存较为便利（取用复苏及保存菌种仅需1分钟）。

瓷珠菌种保存管的优点 用途：菌种保存、复苏和运输 优点：操作简洁便利、菌种保存快速、包装物体积小、菌种保存时间长 操作简洁便利：挑取细菌新奇纯培育物，接入菌种保存管 菌种保存快速：混匀后，吸出冷冻保存液 包装物体积小：1.8ml冷冻管 菌种保存时间长：2-8℃可保存6个月；-20℃可保存12个月；-80℃可保存24个月 瓷珠菌种保存管的使用方法 菌种保存流程 1.从培育18h以上的平板上刮去新奇纯培育物于菌种保存管中，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液 2.拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，不能旋摇 3.用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取洁净，妥当放置被吸出的液体 4.拧紧保存管，快速将其置于-20℃或-70℃冰箱中 使用时的留意事项 被保存的菌种要求是经过纯化后培育 18-24h 内的新奇菌种（细菌18-24h，酵母菌需3 天，形成孢子的微生物保存孢子，而放线菌和丝状真菌需培育7 天后保存），不宜使用老化或未经鉴定的菌种 菌种保存浓度必需要做3-4 麦氏比浊度，如接种浓度过低将会降低复苏效果。

待保存于菌种保存管中的菌种完全乳化匀称吸附在多孔小瓷珠后，要将多余的菌种保存液吸取出来并弃之，否则在复苏时的冻融过程中会损伤菌株活性 做厌氧菌保存时，应供应厌氧的环境，如厌氧箱、厌氧袋，菌种保存管中可通入氮气来驱除保存菌种时所引入的氧气菌种复苏时，也要制造厌氧的环境 菌种复苏完成后，对使用菌株需要进行再次纯化，以保证菌株的单一性 常见问题答疑 1、菌种保存管能保存霉菌及酵母菌吗？ 答：可以对于霉菌等真菌需培育7 天进行保存，而酵母菌需培育三天将孢子洗脱下来进行保存，保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附孢子和菌丝，相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用 2、全部的菌都能保存吗？假如不是的话，什么样的菌可以保存？什么样的菌不行以保存？ 答：可以菌种保存的原理是预防或减缓DNA 复制时自发突变导致菌种退化，因此要制造代谢不活泼的状态，而菌种保存时使菌种进入休眠态（孢子、芽孢)，并制造干燥、低温、缺氧、缺养分的环境，制造的环境越接近此状态，所保存的菌种的时间就越长，所以从原理上讲，全部菌种都可用这种方法保存， 但需要留意的是，苛刻菌（如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌）等特别细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。

3、能用菌种保存管永久保存菌株吗？ 答：温度越低，保藏效果越好从目前的试验数据及实际保存效果来看，-20℃可保存1-5 年，-80℃或液氮中可保存5-10 年，不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同（例如：大肠、沙门等常规细菌-20℃我们目前可以保存到6年）但需要留意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定，确定菌株无变异 4、菌种保藏时为什么要进行分别纯化？ 答：分别纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则 5、菌种保存管对于平板来说，对选择菌落个数有要求吗？还是将整个平板的菌落全部刮入管中？ 答：对于要保存的细菌一般是要进行2-3 次的纯化，要保证一个平板上的菌是由单一菌落传代而来的，所以在细菌保存的过程中，为了保证制备的菌悬液可以达到3-4MCF，是可以将整个平板的的细菌全部刮到管中的，假如平板长的比较满一般半个平板就够用，详细用量也依据菌种的不同有所差异，如霉菌、酵母菌在保存时，不适合用浊度法 6、对于液体培育基培育的纯菌，是否也可以用咱们的菌种保存管？假如可以的话，怎么操作？ 答：是可以用的，假如液体培育基能保证是纯菌的话，可以直接离心，弃掉上清，然后把保存管中液体吸进去充分混匀，然后再转移到菌种保存管中，整个过程要留意无菌操作。

不过，一般菌种保存管最好选择平板菌落进行保存，由于液体培育基中有杂菌是不易观看出来的 7、为什么在菌种保存时，要上下颠倒？为什么不能旋摇？ 答：上下颠倒，可使菌悬液充分混匀，菌株充分、匀称地吸附到小瓷珠上，旋摇不利于菌悬液充分混匀,反而会使菌株全部沉淀于管底 8、为什么在使用时要将管内的液体尽可能多的吸出？ 答：吸出液体可避开反复冻融形成的冰晶对菌株的损伤，加快复苏的过程，因此，要尽可能的将与菌种混匀后的保存液吸净而常用的甘油法，在复苏的过程中需用水浴锅快速溶解，在此过程中，对菌株损害较大 9、在使用后，菌种保存管的保存环境？需要-80℃冰箱吗？ 答：本公司菌种保存管采纳的是低温冷冻保存法，因此，使用后，需放置低温环境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且温度越低，保存效果越好用户需依据菌种的保存要求选择详细保存温度 10、为什么说，假如有条件的话，菌种保存管最好置于-80 冰箱或液氮中？ 答：由于，贮存在-70℃以下低温中能削减冰晶形成，可极大降低冰晶形成对细菌的损害，同时可为被保存的菌种制造更低的代谢环境，从而延长细菌保存的时间 11、为什么在取用菌株时，操作过程要求快速？ 答：菌种保存复苏的原则，要求慢冻快融，之所以要求快速，是由于在菌种复苏的过程中, 长时间的溶解过程会对所保存的菌种造成损伤，而我们经过改良的保存方法最大程度的避开复苏所造成的影响，但我们还是建议遵循菌种的保存复苏原则，保证所复苏菌种的复苏率。

12、将菌株反复冻存，究竟对菌株有什么影响？ 答：低温会使菌株细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感假如放到低温（不是一般冰箱）进行冷冻时，会产生冰晶，冰晶呈针状，极易导致细菌的严峻损伤用电镜观看，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔，当从低温下移出并开头升温时，冰晶又会变大，故反复冻存，会对菌株造成极大损伤 13、为什么有时候菌种的保存效果不佳？ 答：1、可能是由于保存后未将保存液吸尽，反复冻融形成冰晶损伤菌株细胞，影响了菌株活性 2、确定所保存的菌种是否为对数生长期的菌种，我们建议一般菌种保存为18小时内的新奇菌种，而霉菌需要待孢子消失后保存其孢子 14、该产品能否用于菌种的运输，假如可以在什么条件下运输？ 答：就目前试验数据而言，我们建议可主要用于一般细菌的短期运输，对于厌氧菌在运输时最好让其处于厌氧环境下，2-8℃运输不超过5 天另外需要说明的是如弧菌属和绿脓杆菌需要常温运输，其对2-8℃温度极其敏感 7。