免疫细胞分离及检测技术.docx

第十三章 免疫细胞分别及检测技术本章考点1. 免疫细胞的分别2. 淋巴细胞外表标志的检测3. 淋巴细胞功能检测技术4. 免疫细胞检测的临床意义第一节 免疫细胞的分别一、外周血单个核细胞的分别1. 原理：外周血中单个核细胞〔淋巴细胞和单核细胞〕的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同， 介于 1.075～1.090 之间，红细胞及粒细胞在 1.092 左右，血小板在 1.030～1.035 之间因而可利用一种比重介于 1.075～1.092 之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使确定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分别2. 试剂：常用的分层液有Ficoll 与Percoll 两种（1） Ficoll 分层液法：主要用于分别外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分别法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层Ficoll 分层液即聚蔗糖-泛影葡胺， 是一种较抱负的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特 点操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks 或 PBS 液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经 2023rpm15-20min 离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。

血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分 层液的界面中其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层见以以下图图 聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995 年 9 月第 1 版第 4 次印刷（2） Percoll 分层液法：是一种连续密度梯度离心分别法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层图 连续密度梯度离心法分别单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995 年 9 月第 1 版第 4 次印刷二、淋巴细胞的分别1. 纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉 花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群主要的方法有：①粘附贴壁法；②吸附柱过滤法；③磁铁吸引法2. 淋巴细胞亚群的分别原则：依据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化依据细胞的特性和 标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法，而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞为阴性选择。

常用的方法包括：①E花环沉降法；②尼龙毛柱分别法；③亲和板结合分别法；④磁性微球分别法及荧光激 活细胞分别仪分别法三、淋巴细胞的保存与活力测定1.淋巴细胞的保存技术（1） 短期保存技术：将分别的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMIl640 或其他培育液稀释重悬短期保存可置于4℃保存2） 长期保存技术：液氮深低温〔-196℃〕环境保存细胞，参与二甲亚砜作为保护剂2.活力测定：最简便常用的为台盼蓝染色法台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力其次节 淋巴细胞外表标志的检测一、T 细胞外表标志的检测1. 特异性抗原检测：用单克隆抗体检测T 细胞外表抗原的方法有两大类：一类是用标记抗体染色，如免疫荧光法、酶免疫法、ABC 法及免疫金银染色法；另一类用抗体致敏的红细胞作花环试验2. 特异性受体的检测原理：T 细胞外表有特异性绵羊红细胞〔E〕受体，当人的 T 细胞与绵羊红细胞悬液按确定比例混合后，置4℃至少 2 小时或过夜，T 细胞外表的E 受体可与绵羊红细胞结合形成玫瑰把戏的花环，称为活性E〔Ea〕花环。

检测 Ea 花环形成细胞可反映受检者的细胞免疫水平3.T 细胞亚群检测：见其次十二章流式细胞仪分析技术二、B 细胞外表标志的检测B 细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以争论 B 细胞各分化发育阶段的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B 细胞在人外周血和淋巴样组织的分布以及疾病时的变化动态，为临床供给诊治相关疾病的有用信息1.B 细胞外表抗原的检测：B 细胞外表有 CD19、CD20、CD21、CD22 和 CD29 等分化抗原，其中有些系全部 B 细胞所共有，而有些仅活化 B 细胞所特有，据此可用相应的 CD 系列单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化或ABC 法加以检测2.SmIg 的检测：大多承受间接荧光免疫法或包括ABC 法在内的酶免疫组化法，关键是选用高效价、高特异性和高亲和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig 抗体，也可分别用各种类型的 Ig，即IgM、IgG、IgA、IgE 等抗血清，检测带有各种类型Ig 的B 细胞，在人外周血中以带有SmIgM 的细胞数为最多B 细胞经荧光标记的抗Ig 抗体染色，细胞膜外表呈现的荧光着色可有不同的形式，开头均匀分布呈环状，其后集中在某些部位呈斑点状，然后又可集在一个部位呈帽状，最终可被吞饮入胞浆直至荧光消逝。

这一现象是由于淋巴 细胞膜由双层类脂组成，上嵌有蛋白分子，在体温条件下，膜呈半液体状，而镶嵌物能在其中移动当 SmIg 抗体发生结合时，由于抗血清为双价，使SmIg 消灭交联现象，这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状， 时间过长，帽状结合物可脱落或被吞饮而消逝，因此染色后，观看时间不能超过30min，或在染色时加叠氮 钠防止帽状物形成或被吞饮三、自然杀伤细胞〔NK〕及功能的检测NK 细胞外表至少存在CD2、CD11b、CD11c、CDl6、CD56 和 CD69 等多种抗原，但均非NK 细胞所特有， 因此极少以CD 系列抗原为指标鉴定和计数NK 细胞，现多检测NK 细胞活性，因NK 细胞具有细胞介导的细胞毒作用，它能直接杀伤靶细胞测定人NK 细胞活性多以K562 细胞株作为靶细胞，而测小鼠NK 细胞活性则用 YAC 细胞株，检测方法多种多样1. 形态法：将效应细胞与靶细胞按确定比例混合温育，继用台盼蓝或伊红Y 等活细胞拒染的染料处理， 然后分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，推算NK 细胞活性2. 酶释放法：将效应细胞与靶细胞按确定比例混合温育，离心沉淀，取上清液检测靶细胞遭破坏后释放出的酶含量。

3. 荧光法：用荧光素标记靶细胞，经与效应细胞共温后，离心去上清，用荧光计检测剩余的活靶细胞的荧光4. 核素法：将效应细胞与靶细胞按确定比例混合共温后，离心检测上清液或剩余靶细胞放射性的量， 间接反映其活性方法有靶细胞胞浆释放法和胞核释放法两种5. 化学发光法：当效应细胞与靶细胞接触时，效应细胞呼吸爆发，生成极不稳定的 O2-及 OH-，放出光子，在发光剂存在条件下，可被光电倍增管承受和计数，发光量与NK 细胞杀伤力气相关第三节 淋巴细胞功能检测技术一、T 细胞功能的检测1.T 细胞增殖试验：又称T 细胞转化试验T 细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变化，在 24～48h 内细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、消灭空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞因此，这种淋巴细胞增殖又称为 淋巴细胞转化据此可推断出淋巴细胞对有关刺激的反响性与功能状态1） 非抗原性刺激物：如植物血凝素〔PHA〕、刀豆素A〔ConA〕、美洲商陆〔PWM〕、脂多糖〔LPS〕，通称促有丝分裂原其中LPS 刺激 B 细胞，PWM 可刺激T 和 B 类细胞，PHA 和 ConA 刺激 T 细胞增殖。

2） 抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等2.T 细胞增殖试验类型（1） 形态法：其原则是将外周血液或分别的单个细胞与适量的植物血凝素〔PHA〕混合，置 37℃培育72h，取培育细胞作涂片染色镜检据细胞的大小、核与胞浆的比例、胞浆的染色性和核构造以及有无核仁 等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡性母细胞和核有丝分裂相以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细 胞，每份标本计数 200 个细胞，计算转化率2） 核素法：绝大多数外周血 T 细胞通常处于细胞周期的G 期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，0从 G 期进入G 期，开头合成蛋白质、RNA 和 DNA 前体物质等，为DNA 复制预备物质根底，然后进入S 期，0 1细胞合成DNA 量倍增，此时假设在培育液中参与3H 标记的TdR，后者掺入合成的DNA 中，据掺入的多少推想细胞增殖程度3.T 细胞介导的细胞毒试验：T 细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T 细胞的特性，凡致敏T 细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标该试验原则 是选用适当的靶细胞〔常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株〕，经培育后 制成确定浓度的细胞悬液，按确定比例与待检的淋巴细胞混合，共温育确定时间，观看肿瘤细胞杀伤的情 况。

二、B 细胞功能的检测1.B 细胞早期活性指标的测定：B 细胞经不同抗原激发即开头分化增殖，初期表现为体积增大，可用仪器加以检测激活的 B 细胞外表MHCⅡ类抗原的表达增多，可用相应的单克隆抗体通过荧光免疫或ABC 法检测2.溶血空斑形成试验：经典的溶血斑试验用于检测试验动物抗体形成细胞的功能，其原理是将绵羊红 细胞〔SRBC〕免疫小鼠，4 天后取出脾细胞，参与SRBC 及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇在平皿内或玻片上，使成一蒲层，置 37℃温育由于脾细胞内的抗体生成细胞可释放抗SRBC 抗体，使其四周的SRBC 致敏，在补体参与下导致SRBC 溶血，形成一个肉眼可见的圆形透亮溶血区而成为溶血空斑〔plaque〕每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少这种直接法所测的细胞为IgM 生成细胞，其他类型Ig 由于溶血效应较低，不能直接检测，可用间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC 混合时，再加抗鼠Ig 抗体〔如兔抗鼠Ig〕，使抗体生成细胞所产生的IgG 或IgA 与抗Ig 抗体结合成复合物，此时能活化补体导致溶血，称间接空斑试验但是上述直接和间接空斑形成试验都只能检测抗红细胞 抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生状况。

假设用确定方法将SRBC 用其它抗原包被，则可检查与该抗原相应的抗体产生细胞，这种非红细胞抗体溶血空斑试验称为空斑形成试验，它的 应用范围较大现在常用的为SPA-SRBC 溶血空斑试验SBA 能与人及多数哺乳动物IgG 的 Fc 段呈非特异性结合，利用这一特征，首先将SPA 包被SRBC，然后进展溶血空斑测定，可提高敏感度和应用范围在该测试系统中， 参与抗人Ig 抗体，可与受检细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的Fc 段可与连接在SRBC 上的 SPA 结合，同时激活补体，使SRBC 溶解形成空斑此法可用于检测人类外周血中的IgG 产生细胞，与抗体的特异性无关用抗IgA、IgG 或IgM 抗体包被SRBC，可测定相应免疫球蛋白的产生细胞，。