蛋白质的沉淀和变性实验.docx

蛋白质的沉淀与变性反应目的(1)了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系(2)学习盐析和透析等生物化学的操作技术原理在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而成为稳定 的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似但是，蛋白质胶 体颗粒的稳定性是有条件的，相对的在一定的物理化学因素影响下，蛋白 质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程 称为蛋白质的沉淀反应这种反应可分为以下两种类型：一、可逆淀汲反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发 生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶 剂中这种作用称为可逆沉淀反应，又叫作不变性沉淀反应属于这一类的 反应有盐析作用；在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等 电点的沉淀等二、不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原 来的天然性质，这时蛋白质已发生变性这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解 于原来溶剂中的作用叫作不可逆沉淀反应重金属盐、植物碱试剂、过酸、 过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

试剂和器材一、试剂1•蛋白质溶液取5m1鸡蛋蛋白蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4-8层纱 布过滤，新鲜配制2•蛋白质氯化钠溶液取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml,充分搅匀 后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)硫酸铵粉末，饱和硫酸铵溶液，3%硝酸银，0.5% 醋酸铅，10% 三氯醋 酸，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5%磺基水杨酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，饱和氯化钠溶液，10% 氢氧化钠溶液二、器材试管，试管架，小玻璃漏斗，滤纸，玻璃纸，玻璃棒，500ml 烧杯，10 ml量筒操作方法一、蛋白质的可逆沉淀反应 蛋白质的盐析作用用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用蛋白质 是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白 质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭受破坏而沉淀析出析出 的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质减低盐的浓度时，还能溶解沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异例如：向含有 白蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出。

加硫酸钱至饱和，则白蛋白沉淀析出另外，在等电点时，白蛋白可被饱和硫酸 镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出所以在不同条件下，用不同浓度的 盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析 目前在腌的生产和制备、科学研究工作和临床化验等工作中广泛应用取一支试管加入3m1蛋白质氯化钠溶液和3m1饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约 10 min，球蛋白则沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒 搅拌，直至粉末不再溶解，达到饱和为止析出的沉淀为白蛋白静置，倒去上 部清液，白蛋白沉淀，取出部分加水稀释，观察它是否溶解，留存部分作透析用二、蛋白质的不可逆沉激反应1.重金属沉淀蛋白质重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出蛋白质在水溶液中是酸碱两性 电解质，在碱性溶液中（对蛋白质的等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带 正电荷的金属离子结合成蛋白质盐在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或 钾盐的形式存在，当加入汞，铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的 盐类而沉淀经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变 性重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。

因 此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金 属盐的食物性中毒但应注意，使用醋酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加 过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解取2支试管，各加入约1m1蛋白质溶液，分别加入3 %硝酸银3-4滴，0.5%醋 酸铅1-3滴和0.1%硫酸铜3-4滴，观察沉淀的生成第一、二支试管再分别加 入过量的醋酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解2．有机酸沉淀蛋白质 有机酸能使蛋白质沉淀三氯醋酸和磺基水杨酸最有效，能将血清等生物体液中 的蛋白质完全除去，因此得到广泛使用取两支试管，各加入蛋白质溶液约0.5 ml,然后分别滴加10%三氯醋酸和5%磺 基水杨酸溶液各数滴，观察蛋白质的沉淀3. 无机酸沉淀蛋白质浓无机酸（除磷酸外）都能使蛋白质发生不可逆的沉淀反应这种沉淀作用可能是 蛋白质颗粒脱水的结果过量的无机酸（硝酸除外）可使沉淀出的蛋白质重新溶解 临床诊断上，常利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中蛋白质的存在取3支试管，分别加入浓盐酸15滴，浓硫酸、浓硝酸10滴小心地向3支试管 中，沿管壁加入蛋白质溶液6滴，不要摇动，观察各管内两液界面处有白色环状 蛋白质沉淀出现。

然后，摇动每个试管蛋白质沉淀应在过量的盐酸及硫酸中溶 解在含硝酸的试管中，虽经振荡，蛋白质沉淀也不溶解4. 加热沉淀蛋白质几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态盐类和氢离子 浓度对蛋白质加热凝固有重要影响少量盐类促进蛋白质的加热凝固当蛋白质 处于等电点时，加热凝固最完全、最迅速在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带 有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝固若同时有足量的中性盐存在，则 蛋白质可因加热而凝固取5支试管编号，按下表加入有关试剂（单位:滴）:试剂 管号蛋白质溶液0.1%醋酸10%醋酸饱和NaCl10% NaOH蒸馏水110————72105———2310—5——2410—52——510———25将各管混匀，观察记录各管现象后，放人沸水浴中加热10 min，注意观察比较 各管的沉淀情况然后将第3, 4，5号管分别用10%NaOH或10%醋酸中和，观察并解释实验结果将3，4，5号管继续分别加入过量的酸或碱，观察它们发生的现象然后，用过 量的酸或碱中和第3, 5号管，沸水浴加热10 min，观察沉淀变化，检查这种沉 淀是否溶于过量的酸或碱中，并解释实验结果问题：1•为什么蛋清可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂？2•蛋白质分子中的哪些基团可以与(1) 重金属离子作用而使蛋白质沉淀？(2) 有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀？3. 高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，为什么？4. 在蛋白质可逆沉淀反应的实验中，为何要用蛋白质氯化钠溶液?。