辛伐他汀对SH-SY5Y神经细胞中胆碱能神经系统的刺激作用.doc

1辛伐他汀对 SH-SY5Y 神经细胞中胆碱能神经系统的刺激作用【摘要】 　 　目的： 研究胆固醇降解药辛伐他汀（Simivastatin）对 SH-SY5Y 神经细胞中胆碱能神经的刺激作用，探讨史他汀类药物在神经退变性疾病中的神经性保护机制方法： 体外培养 SH-SY5Y 神经细胞（源于人神经母细胞瘤细胞） ，在培养液中加入辛伐他汀培养 48 h，然后用比色法测定细胞 MTT 还原率及胆碱酯酶活性，用蛋白印迹方法测定尼古丁受体 α7 和 α3 蛋白水平，RT-PCR方法测定该类受体 mRNA 表达水平结果： 辛伐他汀能降低培养细胞中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性（分别降低 41.9%和 18.1%） ；增强尼古丁受体 α7 亚单位的蛋白和 mRNA 表达水平（分别升高 23% 和 32%） ，但对 α3 无明显影响结论： 辛伐他汀可以刺激胆碱能神经系统，可能具有神经性保护作用 【关键词】 辛伐他汀； 胆碱酯酶类； 尼古丁受体； SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞［Abstract ］ Objective: To investigate the effect of simivastatin on cholinergic nerve system and to understand neuroprotective mechanisms of the drug in neurodegenerative diseases. Methods: SH-SY5Y cells (human 2neuroblastoma cell line), were incubated with simivastatin for 48 hr. The MTT reduction and cholinesterase activity were measured by using photometric method; the expressions of nicotinic acetylcholine receptor (nAChR)subunits α7 and α3 at protein and mRNA levels were detected with Western blotting and RT-PCR techniques respectively. Results: Simivastatin inhibited the activities of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase by 41.9% and 18.1%, respectively, in the cultured cells. The drug increased the expressions of nAChR α7 at both protein and mRNA levels by 23% and 32%, respectively; however, it dose not induce any changes in the expression of nAChR α3. Conclusions: Simivastatin can stimulate the cholinergic nervous system and may play certain neuroprotective effects.［Key words］ Simivastatin; cholinesterases; receptors, nicotine; SH-SY5Y cells史他汀类药在临床主要用于降低体内胆固醇水平，治疗高血压病。

近年的研究表明，胆固醇水平升高和代谢改变与神经退变性疾病（如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病）的发生有密切的关系[1]β 淀粉样蛋白是阿尔茨海默病发病机制中的关键物质之一已发现高胆3固醇可增强 β 分泌酶的活性，使 β 淀粉样蛋白前体蛋白分解产生 β淀粉样蛋白增多；降低胆固醇水平可使 α 分解酶活性增强，而减少β 淀粉样蛋白的生成[2]史他汀类药物通过降低胆固醇合成来缓解阿尔茨海默病的发生率；另外，史他汀类药物还通过非胆固醇依赖性的作用来发挥作用，但其在阿尔茨海默病发病中的神经保护作用机制仍不十分清楚[3]为此，本研究用体外培养的神经细胞，研究辛伐他汀（Smivastatin，史他汀类药物的一种类型）的神经保护作用机制1 材料与方法1.1 材料源于人脑的神经母细胞瘤细胞株 (SH-SY5Y 细胞）购于 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures 公司（德国） ，辛伐他汀购于 Pfizer Laboratories 公司 （美国） ，尼古丁受体 α7 和 α3 亚单位引物由瑞典 Gen Bank Accession 公司合成，羊抗 α7 和 α3、鼠抗 β-肌动蛋白（β-actin ）多克隆抗体及辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗羊及抗鼠二抗购自 Santa Cruz Biotechnology Inc（美国） ；D-MEM 培养液购自 Gibco Introvagen 公司（英国） ，胆碱酯酶测定试剂硫代乙酰胆碱（ ATC） 、硫代丁酰胆碱(BTC)、5 ，5’- 联硫代- 双-2-硝基苯甲酸（DTNB） 、4BW284C51（AChE 的抑制剂） 、iso-OMPA（BuChE 的抑制剂） ，均购自 Sigma 公司；RNA 提取试剂盒、cDNA 合成试剂盒购自Ambion 公司。

1.2 细胞培养和处理用含有 15%胎牛血清，100 U/ml 青霉素和 100 U/ml 链霉素的 D-MEM 培养液培养 SH-SY5Y 细胞，培养箱中含 5% CO2，温度为 37 ℃在含 SH-SY5Y 细胞的培养液中加入不同浓度的辛伐他汀，培养期为 48 h1.3 测定方法MTT 测定：用比色法测定 MTT [3-（4 ，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide] 水平，以此反映细胞的损伤程度和功能状况[4]用 Ellman 比色法测定胆碱酯酶活性[5]参照 Guan 等[6]的方法提取细胞蛋白并定量，用蛋白质印迹 （Western blotting）方法检测尼古丁受体 α7 和α3 亚单位蛋白表达水平细胞 RNA 按总 RNA 提取试剂盒说明书提取，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定尼古丁受体 α7和 α3 亚单位的 mRNA 水平，步骤和 PCR 循环条件参考Hellstrom-Lindahl 等[7]的方法尼古丁受体 α7 和 α3 亚单位5mRNA 的引物序列见表 1表 1 尼古丁受体 α7 和 α3 亚单位mRNA 的引物序列（略）1.4 统计学处理结果用两因素析因设计资料的方差分析方法和成组设计资料的 t 检验方法进行处理，P<0.05 或 P<0.01 表示差异有显著性或高度显著性意义。

2 结果2.1 细胞存活率结果显示，用不同浓度辛伐他汀（0.01~100 μmol/L）处理SH-SY5Y 细胞，大剂量（10 μmol/L 以上）可引起 MTT 还原率百分比降低（图 1） ，适量浓度不损伤神经细胞，因而选择 0.1 μmol/L 辛伐他汀作为处理体外培养神经细胞的适宜浓度2．2 胆碱酯酶活性用 0.1 μmol/L 辛伐他汀处理培养细胞后，乙酰胆碱酯酶活性和丁酰胆碱酯酶活性均较正常对照组分别降低 41.9%和18.1%（表 2） 表 2 经辛伐他汀处理后 SH-SY5Y 神经细胞中胆碱6酯酶活性（略）注：与对照组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.012.3 尼古丁受体 α7 和 α3 亚单位蛋白和 mRNA 水平用辛伐他汀处理培养细胞后，尼古丁受体 α7 亚单位蛋白水平较正常对照组升高 23% （图 2A） ，而尼古丁受体 α3 亚单位蛋白（图 2B）则无明显改变从图 3A 可以看出，尼古丁受体 α7 和α3 亚单位 mRNA 分离效果较好，与设计的管家基因（Cyclophiline）分离区别清楚；与对照组相比（图 3B） ，尼古丁受体 α7 亚单位 mRNA 水平明显升高 32%，而尼古丁受体 α3 亚单位 mRNA 水平则无明显改变。

3 讨论阿尔茨海默病（AD）是一种严重影响老年人健康的神经退变性疾病，临床上主要表现为记忆力逐渐降低、识认功能障碍，是痴呆症的主要类型，其主要发生机制与 β-淀粉样蛋白在脑组织中大量沉积有关[8]β 淀粉样蛋白是通过 β-分泌酶和 γ-分泌酶切割 β 淀粉样蛋白前质蛋白（APP）所产生近年来大量的研究表明，高胆固醇可增强 β 淀粉样蛋白前质蛋白代谢过程中 β-分泌酶的活性，使 APP 分解产生 β-淀粉样蛋白增多7体内的胆固醇通过甲羟戊酸通路进行合成，该合成通路中的限速酶是羟甲戊二酰辅酶 A 还原酶目前认为，史他汀类药物可通过抑制甲羟戊酸通路中羟甲戊二酰辅酶 A 还原酶的活性来抑制胆固醇的合成，达到治疗血管性疾病的目的近年来的研究发现，由于降低胆固醇可减少 APP 代谢过程中 β-淀粉样蛋白的生成，对 AD有治疗作用[9]另一方面，史他汀类药也可通过非胆固醇依赖性作用机制来达到缓解 AD 症状的目的[10]研究表明，史他汀本身就有增强 APP 代谢中 α-分泌酶的作用，使 β-分泌酶的作用减弱，从而减少 β 淀粉样蛋白生成神经型尼古丁受体是第二信使非依赖性、门控性离子通道受体，既可与神经性递质结合，本身亦是离子通道，其通道开放不需第二信使的参与。

α7 尼古丁受体亚型和 α4β2 尼古丁受体亚型是脑组织中神经型尼古丁受体的主要类型，在 AD 发病机制中起着重要的作用[10] 当前，α7 尼古丁受体亚型受到了越来越多的重视，该受体亚型除了与大脑学习、记忆和识认功能密切相关外，还有明显的神经保护性作用，与 β-淀粉样蛋白的作用机制也有一定的联系胆碱能系统在记忆的形成和维护中起着重要作用，胆碱酯酶也与 AD 的发病密切相关，胆碱酯酶的水解底物乙酰胆碱缺失的严重程度与痴呆程度相一致大量的研究发现，在 AD 病人脑组织中，8总胆碱酯酶活性降低；然而在老年斑及其周围脑组织中胆碱酯酶活性却是升高的，这也是导致 AD 病病理改变的重要因素[5] 目前世界上 AD 最为成熟的治疗方法是采用胆碱酯酶抑制剂来降低患者脑内胆碱酯酶的水平，提升神经递质乙酰胆碱的水平，补偿胆碱能功能的缺失我们的研究发现，用辛伐他汀处理体外培养的神经细胞后，可明显降低细胞乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，表明辛伐他汀有助于提高脑组织中乙酰胆碱及丁酰胆碱含量，有助于增强胆碱能神经系统的功能我们过去的研究中用洛伐他汀（Lovastatin ，史他汀类药物之一）处理体外培养的 PC12 神经细胞，发现洛伐他汀使细胞中125I 标记的 α-金蛇环毒素配体与 α7 尼古丁受体结合密度升高，增强 α-7 尼古丁受体 mRNA 表达水平，对抗 β-淀粉样蛋白引起的脂质过氧化[11] 。

本次研究中，使用另一种史他汀类药物——辛伐他汀处理 SH-SY5Y 神经细胞后，观察到辛伐他汀对 α7 尼古丁受体亦有上调作用，表现为 α7 尼古丁受体蛋白水平和 mRNA 表达水平均明显升高结果表明，辛伐他汀能降低培养细胞中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，使尼古丁受体 α7 亚单位蛋白和 mRNA 表达增强，表明辛伐他汀通过降低胆碱酯酶的活性，减少乙酰胆碱的分解，刺激胆碱能系统，上调 α7 神经型尼古丁受体，具有一定的神经性保护作用9【参考文献】[1]Puglielli L, Tanzi RE, Kovacs DM. Alzheimer’s disease: the cholesterol connection [J]. Nat Neur。