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糖化酶的研究进展摘要：糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究关键词: 糖化酶; 特性; 活力一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500 年前，我国已用糖化曲酿酒本世纪 2O 年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产50 年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)](缩写 GA 或G), 糖化酶是一种习惯上的名称,学名为 α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace).糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成 （ 深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌，但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养）重要糖化酶生产菌有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉等糖化酶是具有外切酶活性的胞外酶。

其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解 a 一 1，4 糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像 B 一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成 B—D 一葡萄糖对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解 a 一 1，6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖糖化酶也能微弱水解 a 一 1，3 连接的碳链，但水解 a一 1．4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到 1 000 000 间，通常碳水化合物占 4％ 18％但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达 80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖Hyun HH 等报道 A.saitoi 糖化酶 GAM1 中糖蛋白包含 18 %中性糖和 0.77 %的葡萄糖胺, 其分子量达 90 000, N 端氨基酸都是同一氨基酸-丙氨酸。

通过对葡萄糖淀粉酶分离纯化的研究, 研究人员将其分为 3 类 GI、 GⅡ、GⅢ或 GAI、 GAI′ 、 GAⅡ, 其中 GAI′ 、 GAⅡ(GI、 GⅡ)对糊化的淀粉进行作用但不能水解生淀粉或作用能力非常弱, GAI ( GⅢ) 对生淀粉发生作用还发现 GAI′ 、 GAⅡ可以通过枯草杆菌蛋白酶对 GAI 作用得到以来自 Asper gillus awamori var.Kawachi 葡萄糖淀粉酶为例, 它们的分子量分别为 GAI MW 90 000、 GAI′ MW73 000、 GAⅡ MW57 000 葡萄糖淀粉酶 GAI 之所以具有对生淀粉水解作用是由于其除了具有包含了催化位的 GAI′ 外还具有与生淀粉相结合的亲合位点 Cp 区域和 GP- l(MWl3 200) , 虽然亲合位点 Cp 与 GP- 1 的复合体对生淀粉具有吸附能力, 但对生淀粉和糊化的淀粉不具有催化能力Shinsaku HAYASHIDA 等 通 过 对 A.awamori vaKawachi、 A.awmori、A. iger 葡萄糖淀粉酶的 GP- I 肽链序列的比较发现它们有很大相似性, 可以推测不同来源的葡萄糖淀粉酶 GAI 有十分相似的亲合生淀粉的位点。

碳水化合物对亲合位点的吸附性能起重要作用 GP- I 区域中 Thr 和 Ser 的含量比较高, 该区域主要是通过 Thr 和 Ser 的残基与寡聚甘露糖类经糖苷键连接组成, 如果将寡聚甘露糖用葡萄糖取代, 则酶对生淀粉的水解作用大大降低根据 Shen dy 等研究人员的报道, 这种糖链与葡萄糖淀粉酶的耐热性有关, 此 Williamson 等人认为 GP- I 区域是酶的催化位点与亲合位点连接的一段肽链骨架目前, 普遍认为糖化酶的多型性可能由下述 3 个原因引起: 一是基因调控、转录的方式不同; 二是蛋白质合成的修饰作用不同, 即结合的糖量不同; 三是在发酵过程中受到自身蛋白水解酶和糖苷酶的作用, 由糖化酶的原始形式衍变成糖化酶的此外培养基的成分和生长条件也对糖化酶组分多型性有影响三、糖化酶的特性1、糖化酶的热稳定性有关糖化酶的热稳定性报道很多 目前, 主要集中在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上 工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高, 细菌产生的糖化酶的耐高温性能优于真菌CLostridium thermohydro- sulfuricum 糖化酶是目前已报道的糖化酶中耐热最高的酶, 在 50 %的淀粉溶液中, 70℃下酶完全稳定, 而且在 10 %酒液中仍很稳定。

即使在 85℃下处理 l h 其酶活性仍保持 50 %, 而且这种酶不受 Ca2+, EDTA 和 α - ,β - ,γ - 环状糊精的影响陈冠军等报道从黑曲霉 As 3.430 9 变异株 B- 11 发酵液中获得的 3 种类型糖化酶 GI, GII, GIII 其适温度均为 70 ℃Hyun H H[3 等曾报道 A.niger IMDCCNO1203 糖化酶活性最高温度均为 70℃α - 环状糊精在 60℃下可使糖化酶的热稳定性提高一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌在 50％的淀粉溶液中，70 ℃下酶完全稳定，而且在 10％酒精液中仍很稳定即使在 85℃c 下处理 l h 其酶活性仍保持 50％，这种酶不受 Ca ，EDTA 和 α-，β-，γ-环状糊精的影响2、糖化酶的 pH 稳定性一般糖化酶都具有较窄的 pH 值适应范围, 但最适 pH 一般为 4.5～ 6.5Tomoko TAKAHASHI 等报道来自于 A.saitoi 的糖化酶 GLUM1 其最适 pH 范围为 2.5～7.5, 最适 pH 值为 4.5 HyunH H 等曾报道 A.niger 产生的糖化酶 pH 值稳定范围为 2～ l1。

一般糖化酶都具有较窄的 pH 值适应范围，但最适 pH 一般为 4.5～6.5不同微生物菌株产生的糖化酶其耐热性、pH 稳定性各不相同真菌、细菌产生的糖化酶由于耐热性较高，巴氏灭活处理不能使酶失活，在啤酒生产中易影响终产品的风味3、糖化酶的底物特异性糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构，同时也受到底物结构及大小的影响许多研究表明，碳链越长，亲和性越大它的最大反应速度随着碳链延长而增加, 呈线形变化糖化酶主要作用于 a- 1,4 糖苷键, 对 a- 1,6 和 a- 1,3 糖苷键也具有活性作用王扬声等报道红曲霉糖化酶的粗酶液能百分之百地分解可溶性淀粉、 直链淀粉、 糖原、 玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 麦芽糖和麦芽二糖等, 对其它碳链较小的底物分解限度则不同程度地降低 管汉成等对黑曲霉变异株糖化酶的底物特异性进行探讨, 发现糖化酶 GAⅠ仅能水解麦芽低聚糖和淀粉, 不能水解甘露糖、 木聚糖、 地衣多糖、 右旋糖苷及 α - ,β - ,γ - 环状糊精, 说明 GAI 对多糖中糖的组成及糖苷键具有较强的专一性, 它水解 a- 1,4 键的速度比 a- 1,6 键快近 100 倍即使是同一糖化酶, 由于具有多型性。

各型组分对同一淀粉的水解也不一样方善康等报道黑曲霉 S4 糖化酶分离纯化得到该酶的 3 个组分 GI, GII, GIII 对底物的吸附能力各不相同, GI 对底物的吸附能力远远高于 GII 和 GIII酶对底物的吸附是有效地降解底物的基础方善康等对 A.niger S4 糖化酶纯化组分的性质进行研究, 发现 GI、GII、 GIII 均作用于生玉米淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉但是各糖化酶组分对这些生淀粉的作用能力均小于对可溶性淀粉的作用能力, 估计作用能力均降低与酶对底物作用的 Km 值上升有关从糖化酶对麦芽糖作用的动力学参数看, 只增加一个葡萄糖单元, Km 却大大降低, Vmax 升高, 即各糖化酶组分对麦芽糖的亲和水解能力均高于麦芽二糖, 表明各糖化酶组分的最小作用底物是麦芽二糖同时也表明了糖化酶对底物的亲和力, 除了与酶本身的结构有关外, 还与寡糖链本身的长度有关四、酶的发酵生产1、糖化酶产酶菌种主要是霉菌，我国多用红曲霉、黑曲霉以及根霉根霉以固体发酵为主，红曲霉和黑曲霉多以深层液体发酵生产2、生产方法2.1 黑曲霉固体发酵法工艺流程：试管菌种一三角瓶款曲扩大培养一帘子曲种一通风制曲一成品。

2.2 液体深层发酵法工艺流程：试管斜面种子一种子扩大培养一发酵一过滤一浓缩一千燥一粗酶剂发酵用基质：碳源为玉米粉、甘薯粉等，有机氯源常用玉米浆、豆饼粉和酵母膏等，常用的无机氯源(NH4)2S04、NH4N03 和 NH3 等，无机盐添加MgS04“7H20、KH2PO4 等菌种不同，产生糖化酶的最适 pH 值也不同，黑曲霉为 4．0～5．0，用黑曲霉生产糖化酶一般控制温度 30℃ ～35℃3、使用糖化酶的优点3.1 糖化酶对设备没有腐蚀性，使用安全使用糖化酶工艺简单、性能稳定、有利于各厂的稳定生产本品质量稳定，使用方便，利于连续糖化，提高产品质量，降低成本糖化酶一般无任何毒副作用.3.2、 使用糖化酶对淀粉水解比较安全，可提高出酒率，麸曲法能减少杂菌感染，节约粮食可降低劳动强度，改善劳动条件 3.3 使用糖化酶有利于生产机械化，有利于实现文明生产.五、糖化酶成品的提取工艺1、成品糖化酶可分为液体酶和固体酶 2 种，而固体酶的制备方法又可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和附吸法等，采用一条合理的提取工艺，可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成本，具体流程如下:2、目前国内对液体酶产品采用的浓缩方法有 2 种，一种为依靠热源来蒸发产品六、糖化酶活力测定方法目前检测糖化酶活力最普遍的方法是用淀粉作底物，通过测定被酶分解产生葡萄糖的含量来定量分析糖化酶的活力。

但针对一些特殊情况还有另外一些方法，如复合糖化酶中作为底物的淀粉同样能被其他类型酶制剂所分解，要是用麦芽糖作底物，相比淀粉底物方法而言，麦芽糖只能被糖化酶专一分解还有在筛选高活力糖化酶菌株时，采用 Starch—PAGE 电泳活性染色法，就可既简便、准确、灵敏，又可节约大量试剂1、用淀粉底物法测定糖化酶活力1.1 方法原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4 葡萄糖苷键生成葡萄糖葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力1.2 酶活力定义lg 固体酶粉（或 1mL 液体酶)于 40℃、pH4.6 的条件下，l h 分解可溶性淀粉，产生 lmg 葡萄糖，即为一个酶活力单位，以 U／g(U／mL)表示2、用麦芽糖底物法测定糖化酶活力2.1 方法原理糖化酶水解麦芽糖生成 D-葡萄糖生成的葡萄糖可通过与葡萄糖脱氢酶反应而测得，葡萄糖脱氢酶（GlucDH)试剂中加入变构酶可将 α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖在 GlucDH 的作用下，β-D-葡萄糖与 NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应生成 NADH，后者即等于葡萄糖初始浓度，可用于分光光度法在340nm 测定其数值。

2.2 酶活力定义麦芽糖 20 eeL，pH4．30，反应温度 37℃ ，反应时间 30min 下，每分钟裂解 1 p,。