基因工程第四章目的基因的分离和合成.ppt

第四章 目的基因的分离与合成n通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”n将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为“目的基因”n获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物，另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功能的研究 7/24/20241第四章   目的基因的分离与合成n获得目的基因的方法：1.限制酶直接分离2.从基因组文库中筛选3.逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选4.人工合成5.PCR扩增6.基因改造 7/24/20242第四章 目的基因的分离与合成第一节 限制酶直接分离一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基因的制备1.对已定序列的DNA分子只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯化所需的DNA片断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆2.对已知定位的目的基因只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次即可获得目的基因7/24/20243第一节第一节 限制酶直接分离限制酶直接分离二、 用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备采用鸟枪法（采用鸟枪法（shot gunshot gun））：1.从细菌细胞中分离细菌染色体2.用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段3.用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体细胞4.转化子的选择7/24/20244鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体染色体DNADNA的切断的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控大小不可控 部分酶切：部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 7/24/20245鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。

如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染谱已知如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体色体DNADNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA 7/24/20246鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进 例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb1.8 kb的的SalISalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNADNA用用SalISalI切开，切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于当于1.6 - 2.0 kb1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收块，从此凝胶块中回收DNADNA片段，然后片段，然后与载体进行拼接与载体进行拼接在连接前将在连接前将在连接前将在连接前将DNADNA片段进行分级分离片段进行分级分离片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb7/24/20247鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构7/24/20248基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因库（基因库（基因库（基因库（gene poolgene pool））））                特定生物体全基因组的集合（天然存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（基因文库（基因文库（基因文库（gene library or gene bankgene library or gene bank））））                从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）基因组文库（含有全部基因）                 存在（人工构建）。

根据构建方法的不同，基因文库分为：存在（人工构建）根据构建方法的不同，基因文库分为：  cDNAcDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）  第二节第二节 建立基因组文库建立基因组文库7/24/20249基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNADNA用用cDNAcDNA法构建法构建cDNAcDNA文库，材料来自文库，材料来自mRNAmRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNAmRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNAcDNA文库文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNAcDNA文库或胚胎组织文库或胚胎组织cDNAcDNA文库等很显然，文库等很显然， cDNA cDNA文库的信息量远小于基因组文库文库的信息量远小于基因组文库第二节第二节 建立基因组文库建立基因组文库7/24/202410基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数率，它与基因文库最低所含克隆数NN之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小 / / 生物基因组的大小生物基因组的大小 例如，人的单倍体例如，人的单倍体DNADNA总长为总长为2.9 x 102.9 x 1099 bp bp，基因文库中克隆片段，基因文库中克隆片段的平均大小为的平均大小为15 kb15 kb，则构建一个完备性为，则构建一个完备性为0.90.9的的基因文库至少需要基因文库至少需要4545万个克隆；而当完备性提高到万个克隆；而当完备性提高到0.99990.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180180万个克隆万个克隆第二节第二节 建立基因组文库建立基因组文库7/24/202411基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的质量标准基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选7/24/202412基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组DNADNA的制备的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。

制备的在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂制备的DNADNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNADNA片段片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAAAAAA用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体DNADNA的长度一般在的长度一般在100 kb100 kb左右左右如果先将细胞固定在低融点凝如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有胶中，然后置入含有SDSSDS、蛋、蛋白酶白酶KK、、RNaseRNase的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb1000 kb大小的大小的DNADNA片段片段7/24/202413基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组DNADNA的切割的切割 用于基因组文库构建的用于基因组文库构建的DNADNA片段的切割一般采用超声波处理和片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证第一，保证DNADNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNADNA片段大小均一片段大小均一超声波处理后的超声波处理后的DNADNA片段呈平头末端，需加装人工接头片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AISau3AI或或MboIMboI等，这样等，这样DNADNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNADNA片段必须根据载体的装载量进行分级片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的分离，以杜绝不相干的DNADNA片段随机连为一体！片段随机连为一体！7/24/202414基因文库的构建程序基因文库的构建程序载体和受体的选择载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的ll-DNA-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YACYAC或或BACBAC载体载体ll-DNA-DNA 由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNAmRNA小于小于10 kb10 kb，因此用于，因此用于cDNAcDNA文库构建的载体文库构建的载体通常选质粒通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下：质粒质粒考斯质粒考斯质粒10 kb10 kb25 kb25 kb45 kb45 kbBACBAC300 kb300 kbYACYAC400 kb400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌7/24/202415第二节第二节 建立基因组文库建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤1、利用λ噬菌体1)获得目的基因的DNA片断n基因组DNA片段化的方法n物理学方法：机械力和超声波n生物化学方法：限制酶（四个核甘酸序列识别位点的酶）2)与噬菌体克隆载体重组，体外包装成噬菌体颗粒3)转染宿主菌4)筛选培养7/24/202416第二节第二节 建立基因组文库建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤2、利用Cosmidn基本与用λ噬菌体载体构建基因组文库相似。

n有如下不同：n制备基因组DNA须特别小心必须保证DNA分子尽可能大n载体的处理比较简单n连接重组时，cosmid的量要比插入片段的量高10倍以上n包装转染后在平板上出现的转化菌落，不是嗜菌斑7/24/202417第二节第二节 建立基因组文库建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤3、利用YACn选用限制酶EcoRI和BamHI对pYAC4载体作双酶消化n选用适当的方法制备生物体完整的染色体DNA，并将其片段化n收集纯化大片段DNA，并与YAC臂连接n转化去壁酵母细胞，利用存在于两臂上的选择标记，筛选含有YAC两臂的酵母细胞7/24/202418第三节第三节 cDNA基因文库的构建基因文库的构建一、一、cDNA基因文库的概念基因文库的概念n某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNAcDNA基因文库基因文库ncDNA序列只与基因的编码序列有关，不能反映基因的内含子，也不能反映基因的转录启动子、终止子等非转录序列ncDNA基因文库可分为表达型和非表达型n表达型cDNA文库的构建：λgt11λgt11n非表达型cDNA文库的构建：λgt10λgt107/24/202419第三节第三节 cDNA基因文库的构建基因文库的构建二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建1.细胞总RNA的制备及mRNA的分离2.cDNA第一条链的合成3.双链cDNA的合成4.cDNA与载体的连接，重组到相应的载体上，导入受体细胞增值7/24/202420二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建1.细胞总细胞总RNA的制备及的制备及mRNA的分离的分离n总RNA：mRNA、tRNA、rRNAnmRNA的分离纯化n利用真核生物mRNA其3‘末端的poly（A）尾巴与oligo（dT）配对特性，制备oligo（dT）型纤维素亲和层析柱7/24/202421二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建2.2.以以mRNAmRNA分子为模板，合成分子为模板，合成cDNAcDNA分子第一链分子第一链nOligo（dT）引导的cDNA合成法n随机引物引导的cDNA合成法7/24/202422二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建3.双链双链cDNA分子的合成分子的合成n自我引导合成法自我引导合成法n碱处理mRNA-cDNA杂交分子，降解mRNAn单链cDNA在3‘端易发生自身环化形成发夹结构为cDNA第二链的合成提供引物n在klenow酶的作用下合成cDNA第二链n用S1酶切割除去单链发夹结构7/24/202423二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建3.双链双链cDNA分子的合成分子的合成n置换合成法置换合成法nRNA酶H和E.coli DNA聚合酶I混合处理mRNA-cDNA杂交分子， RNA酶H在杂合双链mRNA链上产生缺口并形成部分cDNA单链区nDNA聚合酶I以残存的mRNA作为引物合成cDNA第二链nT4-DNA连接酶修复缺口7/24/202424二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建3.双链双链cDNA分子的合成分子的合成n引物合成法引物合成法n在第一链合成完毕后，变性残留的mRNA，用末端转移酶在cDNA游离的3‘羟基端添加同聚物（dC）末端n将其与人工合成的oligo-dG退火，形成引物结构n在klenow酶的作用下，合成第二条cDNA链。

nPCR法7/24/202425二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建双链平头的双链平头的cDNAcDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是ATAT同聚物尾，这样重组同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和S1S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 7/24/202426二、二、cDNA基因文库的构建基因文库的构建5.双链cDNA克隆的筛选n探针原位杂交法n差示杂交法7/24/202427cDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有分子都具有分子都具有polyApolyA结构结构结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短半衰期很短半衰期很短mRNAmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难分离纯化困难分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 7/24/202428三、三、PCR扩增法扩增法 PCR PCR（（（（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶）法，又称为聚合酶）法，又称为聚合酶）法，又称为聚合酶链反应或链反应或链反应或链反应或PCRPCR扩增技术，是一种高效快速的体外扩增技术，是一种高效快速的体外扩增技术，是一种高效快速的体外扩增技术，是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序聚合程序聚合程序聚合程序 使用使用使用使用PCRPCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或基因或基因或基因或DNADNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物需的双引物需的双引物需的双引物 PCRPCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理7/24/202429四、基因的化学合成四、基因的化学合成1.DNA的化学 DNA合成仪2.酶促法n全片段酶促连接法全片段酶促连接法n人工合成组成一个完整基因的所有寡核甘酸片段，相邻的片段间有4-6个碱基的重叠互补n相互互补的寡核甘酸片段复性，形成双链寡核甘酸片段n用T4连接酶连接n酶促填充法酶促填充法7/24/202430四、基因的化学合成四、基因的化学合成1.DNA的化学 DNA合成仪2.酶促法n全片段酶促连接法全片段酶促连接法n酶促填充法酶促填充法n合成目的基因其中的一些片段，在这些相邻的片段的3‘端有一短的序列互补n复性形成模板n用klenow酶去填补互补片段间的单链区域7/24/202431化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNADNA的的的的单片段愈短，收率就单片段愈短，收率就单片段愈短，收率就单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为为为为95%95%则合成则合成则合成则合成5050个碱基长的个碱基长的个碱基长的个碱基长的DNADNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7%7.7%7/24/202432化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的编码的DNADNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNAcDNA法得到法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在17-2017-20个核苷酸之间个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域7/24/202433化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作 化化学学合合成成DNADNA的的实实质质是是按按照照序序列列要要求求将将脱脱氧氧核核苷苷酸酸单单体体一一个个个个接接上上去去，，每每接接一一个个单单体体就就是是一一个个循循环环反反应应，，包包括括：：基基团团保保护护、、分分离离、、缩缩合合、、分分离离、、去保护五大操作单元。

去保护五大操作单元 从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，DNADNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式前者操作繁液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNADNA合成仪就是根合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的据固相亚磷酸液三酯法原理设计的7/24/202434DNADNA化学合成的用途化学合成的用途化学合成的用途化学合成的用途合成天然基因合成天然基因合成天然基因合成天然基因修饰改造基因修饰改造基因修饰改造基因修饰改造基因 设计新型基因设计新型基因设计新型基因设计新型基因 制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等基因等基因等基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 7/24/202435目的基因的分离1.目的基因的功能克隆1)根据特异蛋白分离目的基因基本过程基本过程：v分离特异蛋白，测定特异蛋白的氨基酸顺序，推测该蛋白的核苷酸序列，合成探针v分离特异蛋白，作为抗原制备抗体，筛选cDNA表达文库7/24/202436目的基因的分离1.目的基因的功能克隆1)根据特异蛋白分离目的基因注意事项注意事项：n合成的探针必须特异的识别目的基因，充分考虑遗传密码的简并性n利用抗体筛选目的基因时，应构建cDNA的表达文库7/24/202437目的基因的分离1.目的基因的功能克隆1)功能互补法克隆基因n利用被克隆的DNA片断与寄主细胞的染色体DNA在功能上的互补性来进行目的基因的直接分离酵母基因组酶切DNA片断λ噬菌体载体营养缺陷型菌株＋基本培养基重组体7/24/202438实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→ 转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点：简便，快速，可靠，是首选方法。

获得的基因一定是完整基因 缺点：适用范围较窄 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性7/24/2024391. 遗传互补法1)  原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因 i. 营养缺陷型受体细胞营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长 ii. 受体细胞（无某种表型）受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的7/24/2024402) 分离步骤分离步骤       分离基因组文库重组分离基因组文库重组DNA分子分子 → 转化适当宿主细胞转化适当宿主细胞 → 涂布在选择培养基上涂布在选择培养基上→随随机挑选阳性克隆，分离重组机挑选阳性克隆，分离重组DNA分子分子 →再转化相同受体细胞再转化相同受体细胞 → 高频转化子高频转化子 →基因的基因的进一步证实和鉴定进一步证实和鉴定 重组重组DNA转化细胞转化细胞                                              SDS-PAGE →出现新蛋白质带出现新蛋白质带原载体转化细胞原载体转化细胞(一一)        分别制备无细胞抽提物分别制备无细胞抽提物    酶活测定酶活测定→酶活性出现酶活性出现非转化细胞（二）非转化细胞（二）                                                 免疫分析免疫分析→与特定抗原反应与特定抗原反应     7/24/2024412．核酸杂交法 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列）优点：不需要基因表达必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i. DNA探针: 分离自某一种生物 ii.寡核苷酸探针: 根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测7/24/202442如：如：Leu-Val-Phe-His-Asp-AlaLeu-Val-Phe-His-Asp-Ala   六肽六肽                QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCNQUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN   对应对应mRNA    N：：ACGT/U        CAN-AAP-GTP-CTP-CGCAN-AAP-GTP-CTP-CG    探针序列探针序列     Q：：CT/U    P：：AG  32种种14聚体混合物，其中必有一种聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测聚体与待测DNA完全互补完全互补*  选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。

选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少这种探针最好用于目的这种探针最好用于目的cDNA分离若用于分离基因，要事先考虑到此探针序列横跨内若用于分离基因，要事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能含子序列的可能此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计    iii. cDNA探针探针: 利用特异性利用特异性 mRNA反转录而成，亦可用不同反转录而成，亦可用不同mRNA 混合物反转录而成混合物反转录而成    iv. PCR探针探针     v. RNA探针探针: 由由T3或或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得7/24/202443  3) 分离步骤分离步骤       基因基因(基因组或基因组或cDNA)文库文库 →制备制备DNA样品膜样品膜→与标记探针杂交与标记探针杂交 →杂交斑点（阳杂交斑点（阳性克隆）性克隆）→分离重组分离重组DNA分子分子 → 作斑点杂交作斑点杂交阳性克隆阳性克隆Southern杂交以确认杂交以确认杂交结果杂交结果 → DNA进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物3. 免疫法免疫法   1) 原理原理          外源外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应反应, 然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA7/24/202444优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性, ,只要抗原决定序列能被正确表达。

只要抗原决定序列能被正确表达 *    外源外源DNA可以是一个完整编码区，也可能是一个外显子，这些序列可以插入可以是一个完整编码区，也可能是一个外显子，这些序列可以插入E.coli表达型载体表达型载体必备条件：待分离基因的表达产物必备条件：待分离基因的表达产物——蛋白质必须纯化和用于制备相应抗体蛋白质必须纯化和用于制备相应抗体   2) 分离步骤分离步骤       基因文库基因文库→蛋白质样品膜制备蛋白质样品膜制备→免疫法筛选免疫法筛选→有色斑点（阳性克隆）有色斑点（阳性克隆）→进一步证进一步证实：分离阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，实：分离阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，western印迹免疫分析；分离重印迹免疫分析；分离重组组DNA，检测插入片段大小，测序等检测插入片段大小，测序等7/24/202445目的基因的分离2.目的基因的序列克隆法1)根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因n用核酸探针进行杂交筛选：根据已知序列合成相应探针，再与基因组文库的克隆进行杂交，筛选阳性克隆，最后分离鉴定2)表达序列标签（EST）法分离目的基因n表达序列标签（表达序列标签（expressed sequence tag ESTexpressed sequence tag EST））:是指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列。

7/24/202446筛选目的基因片断的差别杂交及减法杂交技术筛选目的基因片断的差别杂交及减法杂交技术1.差别杂交（差别杂交（differential hybridization））法法应用前提应用前提：：需要拥有两种不同的细胞群，即在一个细胞群中目的基因能正常需要拥有两种不同的细胞群，即在一个细胞群中目的基因能正常生长，而在另一细胞群中目的基因不表达生长，而在另一细胞群中目的基因不表达Fig4-21Fig4-212.减法杂交（减法杂交（subtractive hybridization））技术技术nmRNA减法杂交减法杂交 fig4-22fig4-22n基因组基因组DNA减法杂交减法杂交 fig4-23fig4-237/24/202447利用差示分析法分离目的基因克隆利用差示分析法分离目的基因克隆1.mRNA差别显示技术（差别显示技术（DD-PCR,DDRT-PCR）） fig 4-24fig 4-242.抑制性减法杂交（抑制性减法杂交（SSH））技术技术n该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的革命性方法，特别适宜于那些差异表达该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的革命性方法，特别适宜于那些差异表达量很低的基因，其富集效率在量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。

倍以上待测待测ds-cDNA（（tester cDNA））和驱动和驱动ds-cDNA（（driver cDNA））fig 4-26fig 4-267/24/202448 4. 4. 染色体巡查法染色体巡查法(chromosome walking)(chromosome walking) 1) 1) 原理原理 利用DNA探针筛选对应重组DNA，然后以插入片段两末端片段为探针选择对应重组DNA，此次筛选的DNA插入片段仅以一端为探针，继续和重复该过程，直至筛选到目的基因优点：可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱，对基因组全序 列测定十分有用 缺点：工作量大，鉴定困难，当巡查高等真核生物染色体时，重复DNA序列区域难以跨越必要条件：两基因间距离应清楚 * 该法的两大难点：限制酶图制作和末端片段探针制备前者可用改进的载体，后者可用RNA聚合酶合成末端探针 2) 2) 操作步骤操作步骤7/24/202449 5. 5. 蛋白质蛋白质-DNA-DNA杂交法杂交法   1) 1) 原理原理     利用某些基因产物可与利用某些基因产物可与DNADNA分子上特异序列结合的特点分离那些参与基因表分子上特异序列结合的特点分离那些参与基因表达调控的基因达调控的基因 DNA DNA探针可以是调控蛋白结合的序列，其长度尽可能短且能获得杂交斑点。

探针可以是调控蛋白结合的序列，其长度尽可能短且能获得杂交斑点小于小于150bp150bp的的DNADNA探针可大大降低非特异性结合探针可大大降低非特异性结合DNADNA探针必须是双链，否则会探针必须是双链，否则会导致大量的非特异性结合导致大量的非特异性结合必要条件：必要条件：目的基因或目的基因或cDNAcDNA必须在宿主细胞中表达必须在宿主细胞中表达   2) 2) 操作步骤操作步骤基因文库基因文库 → → 制备蛋白质样品膜制备蛋白质样品膜 → → 与标记与标记DNADNA探针探针 → → 阳性克隆阳性克隆 → →序列测定序列测定 → → 基因表达基因表达 → → 蛋白质蛋白质-DNA-DNA结合实验结合实验 → → 特异性特异性DNADNA序列分析和进一步确证实序列分析和进一步确证实验（足迹分析技术等）验（足迹分析技术等）7/24/202450 6. 蛋白质-蛋白质结合法---酵母双杂交法 1) 原理 利用酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UASUAS（upstream activating sequence，上游激活序列）报告基因表达筛选目的基因的方法。

i.   GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列； ii.  GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)这两个结构域可以单独起作用       7/24/202451     iii. 如果如果AD和和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互发生分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互发生结合，就可导致结合，就可导致GAL1-LacZ基因的表达其中与基因的表达其中与BD融合的基因称之为融合的基因称之为钓饵基因钓饵基因，与，与AD融合的基因可称之为融合的基因可称之为目的基因目的基因(即建立的基因文库即建立的基因文库)                为了提高报告基因的表达活性，为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以与基因还可以与HIS3基因融合在基因融合在一起，只有当一起，只有当HIS3基因表达量足够大时，转化细胞才能在合成培养基基因表达量足够大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。

上生长2)  操作步骤操作步骤构建钓饵融合基因（构建钓饵融合基因（BD））                                                     转化相应的酵母菌株转化相应的酵母菌株      在检测平板上筛选在检测平板上筛选构建文库（构建文库（AD））                        阳性菌落阳性菌落      提取质粒提取质粒DNA，转化大肠杆菌，转化大肠杆菌 阳性克隆的进一步鉴定阳性克隆的进一步鉴定 7/24/202452个人观点供参考，欢迎讨论。