利用基因芯片分析孕妇外周血浆APC基因甲基化的初步研究医学论文.doc

利用基因芯片分析孕妇外周血浆APC基因甲基化的初步研究_医学论文 作者:黄钧，葛芹玉，蒋犁，蒋小青，陆祖宏【摘要】 目的 研究孕妇外周血浆中APC基因甲基化模式与孕妇妊娠状态的关系，探讨其应用于无创性产前诊断的可行性 方法 从不同妊娠时期孕妇和健康未孕妇女外周血浆标本中提取APC基因，经过亚硫酸氢钠转化后，利用基因芯片方法检测分析APC基因启动区一组CpG位点的甲基化模式，并对不同妊娠时期以及健康未孕样品进行了分析比较 结果 健康未孕妇女血浆中APC基因是未甲基化或低甲基化的，而在妊娠状态下是高甲基化状态的，但不同妊娠时期甲基化程度有所不同 结论 孕妇外周血浆APC甲基化模式的变化与妊娠状态和时间均有一定的关系，基因芯片方法可以高通量的检测分析血浆DNA甲基化状态血浆DNA甲基化的分析进一步应用于无创性产前诊断具有可行性关键词】 无创性产前诊断；DNA甲基化；基因芯片；APC基因A microarray to analyze methylation pattern of the APC gene in maternal plasma in pregnant woman 【Abstract】 Objective Detection of the relationship between methylation pattern of the APC gene in maternal plasma in pregnant woman and the state of pregnancy， and estimation the potentiality that applicate to noninvasive prenatal diagnosis. Methods Plasma DNA was isolated from peripheral blood of pregnant women， then after bisulphate-treat， the methylation pattern of CpG site in the APC promoter were analyzed by DNA microarray-based method. The methylation pattern of differential stages in pregnant women and nonpregnant women were compared by DNA microarray. Results The methylation prattern of CpG site in the APC promoter in healthy nonpregnant women are densely methylation and in pregnant women are hypomethylation or unmethylation. The degree of methylation in pregnant women are distinction. Conclusion There are relationship between the methylation pattern of the APC gene in maternal plasma in pregnant women and the pattern of the differential stages and times of pregnancy. The DNA microarray can be applied as a high throughput tool to map methylation patterns in CpG island sites. The analysis of DNA methylation in plasma will have the powerful potentiality that applicate to noninvasive prenatal diagnosis. 【Key words】 DNA methylation; noninvasive prenatal diagnosis;gene microarray; APC gene1997年，Lo等［1］首次报道在母体血循环中发现了游离胎儿DNA，证实了母体血浆中的DNA是胎儿和母体DNA的混合体，这一发现为无创性产前诊断开辟了新的方法。

但以往对孕妇外周血中游离胎儿DNA的应用大多局限在检测胎儿从父亲一方继承来的基因或突变，且检测的胎儿基因必须能与母亲DNA 序列显著区分开来2002 年， Poon等［2］利用后生性标志，如胎儿与母体DNA 甲基化的差异来区分两者，冲破了上述限制，这种表遗传上的差异为无创性产前诊断提供了新的思路但是，对在妊娠与未孕妇女外周血浆中基因甲基化模式是否存在一定的关系，在不同妊娠期之间孕妇血浆中基因的甲基化模式是否存在一定关系等问题，目前还没有报道正常妊娠时，细胞滋养层细胞侵入子宫蜕膜及其脉管系统，其发生在妊娠8～18周之间，侵入过程与癌细胞在转移的时候有一些相似，因为细胞必须通过基底层先兆子痫的发病机制可能与滋养层细胞在妊娠前3个月侵入子宫肌层失败有关Muller等［3］发现妊娠妇女和转移性乳腺癌病人在APC基因甲基化的改变上存在相似性因此，本实验选择APC基因作为研究对象本实验以妊娠不同时期APC基因启动区不同CpG位点甲基化模式为基础，通过基因芯片对其变化 规律 进行探索性研究，寻找出它们之间的差异，以期可以作为生理或疾病状态的标志物，并进一步应用于无创性产前诊断1 资料与方法 1.1 研究对象 从2005年5月～8月在东南大学附属中大 医院 妇产科进行产前检查的初孕妇中，随机选择82例作为研究对象，其中妊娠4～12周(早期)24例，13～27周(中期)24例，28～40周(晚期)24例，产后1周10例。

年龄23～35岁，初孕，临床无感染征象，无其他产科合并症及并发症同时随机选取未孕健康女性18例作为阴性对照组1.2 标本收集和处理 对所有研究对象抽取5ml外周血EDTA抗凝在24h内，先1600g 离心10min初步分离血浆，再于16000g下离心10min，充分去除细胞碎片等，获得纯净的血浆样品，血浆DNA采用标准酚－氯仿方法提取1.3 血浆DNA的亚硫酸转化 取8μl 的DNA加双蒸水至20μl ，加3M的NaOH 2μl解链，42℃水浴15min在每个样品中加入5M的对苯二酚/亚硫酸氢钠溶液360μl，50℃水箱孵育12～16hDNA过柱纯化(prgmaga公司)将DNA转移入新EP管中，加入3M的NaOH 5μl，水浴15min醋酸钠、无水乙醇沉淀DNA次日用30μl 的TE重新溶解 1.4 APC基因的不对称PCR扩增 APC基因上游引物5’-GGGGTTAGGGTTAGGTAGG-3’，下游引物5’-AACTACACCAATACAACCACATA-3’PCR反应体系：反应体积25μl，包括10×PCR buffer(有MgCl2) 2.5μl，10mmol/L Cy3-dNTP 2μl，10mmol/L上游引物0.5μl，10mmol/L下游引物2.5μl，模板DNA 1μl，5u/μl Taq酶 0.2μl，灭菌双蒸水18.5μl。

PCR扩增条件：95℃ 3min预变性，94℃ 30s变性，57℃ 30s退火，72℃ 40s延伸，40个循环，72℃延伸8min，4℃保存1.5 基因芯片的制备 在洁净的载玻片上，用2ml 1.2%的琼脂糖溶液均匀的平铺在玻片表面，待其凝固后置于37℃烘干使用前将其浸泡于0.1mol／L的NaIO4溶液中30min，再用蒸馏水洗片3次，每次5min，晾干后备用在APC基因启动子区甲基化位点较多的区域设计了16个CpG位点(分布于5个探针)和一个阴性对照，6个探针点样于膜片上探针固定后备用1.6 芯片杂交 在各管中加入15μl的转化产物和15μl的杂交缓冲液，置于95℃水浴锅变性7min将变性好的杂交液滴于玻片上的点样区，并用18mm×18mm盖玻片盖于其上，然后避光置于37℃杂交2h，分别用2×SSC+0.2% SDS液、0.1% SSC+0.2% SDS液、0.1% SSC液洗涤共10min，室温晾干后用ScanArray 5000 扫描仪扫描1.7 芯片扫描和结果判定 对芯片扫描得到Cy3 图像文件通过圈点确定杂交范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值，用预先定的内参照基因(植物基因) 对Cy3 的原始提取信号进行均衡和修正；用stroppro2.0 软件分析Cy3 荧光信号的强度和比值。

用以下3 个条件作为判定基因阳性表达的标准: (1)Cy3 阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信号的3倍，ratio 比值范围在2.7～3.3； (2) 阴性荧光信号值<600，Cy3 阳性荧光信号值减去阴性荧光信号值后>400；(3)PCR结果良好1.8 统计学处理 以上杂交过程均重复3次，数据取3次试验结果的平均值，数据以均值±标准差 (x±s )表示用统计学处理采用SPSS11.5分析软件进行方差分析和SNK法进行统计分析比较统计检验的显著性设在 P <0.052 结果 2.1 血浆DNA的亚硫酸氢钠转化 提取出的血浆DNA经亚硫酸氢钠预处理后，非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，随后进行PCR扩增，此过程进一步将模板上的尿嘧啶转化为胸腺嘧啶；而甲基化的胞嘧啶不受影响，保持不变根据所选引物，APC的扩增片段为178bp，见图1 1:健康 2：产后 3、4:早期5、6:中期 7、8:晚期 M：marker图1 亚硫酸氢钠转化后APC基因扩增产物的琼脂糖电泳结果2.2 基因芯片的杂交结果2.2.1 中期妊娠和健康未孕样品中APC启动子区甲基化模式比较 图2中2与5显示其芯片扫描结果，由图中可见，在妊娠中期c、d探针上杂交点的信号相对较强，在未孕妇女样本中荧光强度值较弱，杂交扫描后s-median 532值组间方差分析表明差异有显著性(P<0.05)，说明 APC基因在健康妇女血浆中是低甲基化或未甲基化的，而在妊娠状态下是高甲基化的。

从而表明妊娠对血浆DNA甲基化程度有着较多的影响，妊娠妇女与健康未孕妇女的甲基化状态有比较明显的差异DNA甲基化作为一种新的产前诊断的标志物可以应用于产前诊断，为无创性产前诊断的 发展 打下了基础图中a、b、c、d、e、f分别表示APC启动区不同CpG位点AP1、AP2、AP3、AP4、AP5的杂交结果，1、2、3、4、5代表妊娠的早期、中期、晚期、产后1周、健康未孕五种妊娠状态图2 妊娠各时期芯片杂交结果图3 妊娠各期与健康未孕妇女APC启动子区不同CpG位点荧光信号图谱及分析2.2.2 不同妊娠时期及未孕样品中APC启动子区甲基化模式比较 笔者进一步对不同妊娠时期APC甲基化变化情况进行了比较，见图2妊娠各时期芯片杂交结果及图3妊娠各期与健康未孕妇女APC启动子区不同CpG位点荧光信号图谱及分析妊娠中期和晚期样品检测结果中APC基因的甲基化状态有相似的模式，而在妊娠早期有较大的差异，杂交扫描后s-median 532值SNK分析表明早、中、晚妊娠期b探针上差异有显著性( P <0.01)，说明不同的妊娠时间APC基因的甲基化模式程度有所不同；在产后样品中，APC基因的甲基化消失迅速，方差分析表明其与未孕样品之间差异无显著性( P >0.01)，说明其与健康样品具有相似的甲基化模式。

3 讨论 自Lo等首次报道母体。