CO2和二类疏水蛋白之间的相互作用的建模和生理特性.docx

CO2与二组疏水蛋白之间的相互作用的建模和生理特性：原始喷涌机制的新发现付臣译自ASBCJ-2012-0905-01摘要：尽管普遍认同疏水蛋白和CO2是造成CO2饱和饮料的原始喷涌的原因，但是这个现象的生物分子机制并没有被很好的理解，在此疏水蛋白HFBII已经被生产、萃取和纯化，一个喷涌实验和DLS分析已经完成，并允许作者设计了一个MD模拟计划以研究CO2分子与HFBII之间的相互作用，结果预示CO2分子倾向于聚积在疏水蛋白的疏水补丁上能达到蛋白质其它区域的两倍，这就提出了这样一个用“纳米炸弹”的形成，阐明了原始喷涌机制的一定的化学和生理性质的模型关键词：CO2,喷涌，疏水蛋白，MD模拟，纳米气泡导言在受污染的象啤7S这样的含有CO2的饮料中，瓶装啤酒在开瓶时，不受控制脱气现象的科学描述，来自受霉菌污染的有机物质参与，以及涉及围绕在被加压的CO2周围的固体膜及大约100纳米（大气压力下气态CO2的临界直径）的球形气体结构的发现的假说，都是报道啤酒原始喷涌机制的基本陈述实际上，所有研究都是说了只言片语，只说原始喷涌的机制，但并没有解释喷涌机制的生理细节先前的研究暗示溶解的气态CO2与疏水蛋白的疏水补丁有关，这个相互作用易受纯的疏水分子，例如不饱和脂肪酸和一些植物提取物如酒花油的存在的影响。

然而，纳米气泡形成的详细机制及关于在一个密闭的受污染的压力容器中发生了什么的原子假说构想仍然没有被阐明，这种纳米结构被定义为纳米炸弹，因为它们将在瓶打开时突然爆发，因此一个深入的物理化学研究被执行以研究在水溶液中气态的CO2存在下疏水蛋白的行为作用一组疏水蛋白SC3和同类型的二组疏水蛋白HFBI及HFBII是理解原始喷涌期间发生的纳米规模变更的基础事件，疏水蛋白聚集成纳米结构的弹性对阐明亲-疏水界面的特殊重新修整是必须的再者，完全有必要理解在潜在污染剂存在的情况下，控制气态CO2在水溶液中溶解的物理法则，所以花费科学家25年的时间去完成一个解释液体中纳米球面结构逐步形成和瓦解的具体模型是可以理解的疏水蛋白是真菌引起的蛋白质（大约100个氨基酸，7-15kDa）,通过它们能在疏-亲水界面如空气和水界面形成两性分子层的能力来定性的，基于在这个聚集层上的溶解度，疏水蛋白被分成两组，一组疏水蛋白能够组装进入蛋白质膜成为刚性膜，除非使用强酸否则很难溶于水中，相反二组疏水蛋白自己组装成一个单层弹性膜，它可以被试剂或使用压力解离原始喷涌看起来主要与二组疏水蛋白有关，并且报道较低的数量（大约3g/L）就足以引起喷涌。

疏水蛋白的疏水补丁被猜想是造成和气态CO2相互作用，导致具有高弹性的疏水蛋白聚集形成膜而致稳定的气态CO2纳米气泡的形成的原因为了理解这样一个机制，要求有一个计算技术的使用，基于经典的牛顿物理学法则，分子动力学模拟用于此研究以了解CO2分子与疏水蛋白HFBII之间在溶剂（水）中自由基键合倾向，总之，通过描述HFBII与分子气态CO2的密切关系，MD结果支持了此实验结果及存在纳米炸弹的假说实验HFBII蛋白的生产里氏木霉MUCL44908在安装有搅拌器的1升的发酵桶中25c发酵7天，含水的培养基由乳糖（40.0g/L）、蛋白陈（4.0g/L）、酵母浸膏（1.0g/L）、KH2P04（4.0g/L）、（NH4）2SO4（2.8g/L）、MgSO2.7H2O（0.6g/L）、CaCl2.2H2O（0.8g/L）及含有FeO4.7H2O（0.5g/L）,CoCl2.6H2O（3.7g/L）、MnSO4.H2O（1.6g/L）和ZnSO4.7H2O（1.4g/L）的微量溶液（2mL/L）组成，用磷酸调节PH到4.5—5.0,最后菌丝体通过离心分离（8,000xg离心25min）,然后上清液在2c下贮存直到将来的分析。

萃取步骤后，上清液泡沫分储，泡沫用一个亲水的聚酯碉过滤器过滤，使用RP-LC来源15RPC色谱柱（4.6X200mm）的液相色谱进行纯化，用线性梯度（从0至60%,50min）的乙晴以1mL/min的流速进行洗脱，并在214nm下进行紫外检测，乙晴为含有0.1%三氟乙酸（TFA）的MilliQ水（millipore公司生产的超纯水）溶液使用带有一个UltraflexII仪器的基质辅助激光解吸/电离飞行时间和a-氟基-4-羟基肉桂酸进行鉴定，一个显微分光光度计（280nm波长，&=10）用于纯化的疏水蛋白HFBII的最终定量喷涌实验和DLS分析喷涌实验和动态光散射（DLS）分析按以前描述的方式进行，研究了在封闭的系统中气态CO2存在的情况下二组疏水蛋白的行为，为此一定数量有纯HFBII被加入冷却到2c的苏达水（7g/LCO2）中，以使HFBII的最终浓度等于0、4.5、9和18g/L,然后进行喷涌实验，并收集溢出泡沫进一步用DLS进行分析MD模拟参数超高分辨率的晶体结构2B97被用于模拟二组疏水蛋白的随时间变化的行为，这个晶体结构是一个含有两个链，A和B链的二聚体构造，在此只获得A链，钮离子和水分子去除的也很好，疏水蛋白是一个中性结构，因此没有抗平衡离子被加入系统，氨基酸适当的质子化状态用MOE分子操作环境软件中的质子化3D工具来核实。

蛋白质被放在一个十二面体的盒子中，蛋白质与盒边的距离设定为0.85nm,以确保在MD拟态期间蛋白质不与它们的影像相互作用，考虑到这些设定，盒子的总体积大约为90nm3,9个CO2分子被随便加入盒中，残余部分用2525TIP3P水分子填充，整个系统（蛋白质、水和CO2）大约包含9000个原子MD模拟所有模拟都用与OPLS-AA力场连接在一起的GROMACS包完成，CO2分子的部分电荷在先前的研究中得到的，通过执行2000步的最速下降及接下来的2000共腕梯度能最小值，系统松弛下来两次平衡被完成，首先是100Ps的等容（NVT系综），然后是100Ps的恒压（NPT系综），在平衡步骤期间，所有重蛋白原子都被位限固定，接下来位限固定被去除，系统在NPT系综下被模拟100ns,每4Ps贮存一个系统快照，通过使用0.1ps耦合常数的V-rescale恒温调节器及分别耦合蛋白质和溶剂，模拟温度保持恒定为外部水浴温度298K通过分别耦合蛋白质和溶剂及使用1ps耦合常数的Parrinello-Rahman恒压调节器，使模拟压力保持外部水浴压力在4atm网络粒子埃瓦尔德法被用于长程静电学计算，一个1.4nm的近路用于范德华力。

LINCS运算法则用于通过限制系统内所有结合力以确保有一个2fs的积分步长测量我们计算了疏水补丁附近10?球体内每？2可及表面积CO2分子的数量，同剩余蛋白质表面积相比较，下面的18个残余物被定义为疏水补丁：Gly6、Leu7、Leu12、Val18直到Val24、Val54直到Ala58、Ala61直到Cys64结果和讨论fHFBII的特性纯化期间生成的RP-LC色谱图的例子显示在图1中，使用MALDI-TOF分析了几个微分后，获得了分子量为7.042kDa的物质，这与缺少末位氨基酸的HFBII分子完全相符，此蛋白质被收集在40-50%的ACN中，末位氨基酸的去除能被解释为生物降解，因为此效果也已经在毒枝毒素中观察到对于所有包含HFBII疏水蛋白的瓶子，喷涌实验和DLS分析（图2）都是阳性的，像Deckers等人描述的一样，当至少100nm直径（即大气压下气态CO2分子的临界直径）的微粒被检测时，DLS分析是阳性的，此直径考虑到了用在MD实验中的CO2分子数量的测定分子动力学模拟尽管喷涌在不同的碳酸饮料中也已经被描述过，但它对于啤酒来说是有最重大意义的，疏水蛋白和CO2是导致原始喷涌的两个主要因素，当HFBII被加到苏达水时，正如在啤酒中一样观察到了喷涌，喷涌机制中重点强调了疏水蛋白和CO2两者的作用。

尽管现在广泛认为疏水蛋白是导致喷涌的主要因子，但我们在此建议CO2扮演了更主要的作用，如果碳酸饮料被装于PET瓶中，随时间的推移观察到喷涌完全消失，此效果能解释为PET瓶易渗出CO2,这导致CO2减少而最终阻止了喷涌潜势当CO2溶解在水中，便产生下面的平衡：I坛1%C03te）.、COJd）+HjO,>H2COi.>HCO/*H**》CO^+2H*Kh是亨利常数，Ks是溶解常数，Ka1和Ka2代表碳酸的两个离解常数二氧化碳与水分子起化学反应形成碳酸，碳酸是不稳定的双质子酸，反应性明显促进了二氧化碳的溶解，溶解常数在25c下等于1.7X10-3,但是H2CO3浓度取决于PH,在PH7.0情况下，80%的碳酸解离为HCO3「，在25c下Ka1=6.4为了获得大约7g/L的CO2浓度，如亨利法则陈述的要施加压力提高CO2的溶解度，CO2在水中溶解越多，碳酸形成越多，解离的HCO3「也越多，同时提高了H+浓度导致了PH降低当PH降低到比Kai值低时，平衡将向左移动，碳酸最终变成CO2,苏达水有终PH为4.0以致于主要的物质都是溶解的CO2,啤酒的情形也没有太大区别，啤酒认为是一种磷酸缓冲液，有PH4.0-4.3,平衡也直接向溶解的CO2进行。

先前为了研究疏水蛋白的行为例如可折叠的及与疏水-亲水表面相互作用的行为，进行了多个MD模拟实验在此我们进行了MD模拟以研究CO2聚集在溶剂中二组疏水蛋白的疏水补丁上，此补丁包含专一的疏水脂肪族侧链，在中央的B-桶结构中形成两个环形区域作为一个核实CO2参数的初始实验，170个CO2分子和2641个水分子被随机加到约90nm3盒子中，系统被模拟100ns,象预期的一样，疏水的CO2分子快速地扩散并在系统中形成聚集体，这个在10ns聚集的一个例子显示在图3中接下来，带有HFBII疏水蛋白、CO2和水分子的系统被模拟100ns,此模拟只有水分子而没有其它成分目的是研究最简单的模式，图4显示在疏水补丁的邻近区域内（10?）CO2分子的数量，在整个轨线期每？2的ASA的CO2数量都被计算，并与蛋白质的其它区域进行对比，能看出疏水补丁的邻近区域，每？2的ASA的CO2分子数量多于蛋白表面的其它区域两倍，这个效果在20ns模拟时间后最强，这被看作需要一个平衡时间使CO2分子聚集在蛋白质表面上图5说明CO2聚集体存在，键合在蛋白质的疏水补丁上，疏水补丁本身就有使疏水的CO2分子紧紧地聚集到蛋白质表面的趋势，能猜想到更多的疏水蛋白存在下这个效果将会被加强，并彼此聚合由此增加疏水补丁区域，并减少和蛋白质其它区域的接触，从模拟实验也看出CO2键合并没有特定发生在疏水补丁上，而且在蛋白质的其它疏水区域也发生了，如图5看到的一样，可能在多量的疏水蛋白低聚反应下，这些区域能被掩埋，从而减少了CO2在这些位置的键合。

值得注意的是，在模拟期间某些CO2分子在疏水蛋白的内腔被捕获，并封存在蛋白质内纳米气泡形成和喷涌机制在CO2和疏水蛋白之间的强相互作用导致了喷涌现象需要的稳定的纳米气泡的形成，在一个封闭容器中，这些稳定的纳米气泡的形成能在6个连续的阶段被描述（图6）0在第一阶段，被CO2污染的疏水蛋白和没有被污染的疏水蛋白都存在于液体中；第二阶段，由于疏水蛋白是两性分子，它们迁移到疏水-亲水液-气界面，在界面上由于与大气中CO2接触都被污染；第三阶段，疏水蛋白在界面上自我组合，当临界浓度到达时形成水晶单层提供能量（例如摇动）给这个封闭系统将会打破通过亨利法规建立的这个平衡，并且疏水蛋白薄层进入液体，这将导致瓶子的亲水玻璃壁与疏水蛋白层的亲水部分之间相互吸引，并且通过气态CO2的聚集，疏水部分将扮演一个纳米气泡形成的停泊地或加油站事实上，为了回到平衡，在气相和液相间CO2分子的交换发生了，由于它们能减少表面张力从72mJ/m2到30mJ/m2的能力，也因为它们的结构弹性，。