免疫学实验二ELISA双抗夹心法PPT精品文档.ppt

实验二、酶联免疫吸附试验实验内容：实验内容：间接法　　－－－测乙型肝炎病毒表面抗体（－－－测乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb））Enzyme linked immunosorbent assay，，ELISA1　　酶联免疫吸附试验（　　酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原首先，抗原、抗体的特异性反应在一体液中微量的特异性抗体或抗原首先，抗原、抗体的特异性反应在一种固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的种固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体游离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合－抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物（间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现物（间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显色反应。

液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借显色反应液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此可检测待测抗原或抗体的有无及含量此可检测待测抗原或抗体的有无及含量　　该技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察　　该技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察实验原理：实验原理：2•免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术其原相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化效能当存在相应酶底物时，酶能催化产生有效能当存在相应酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的抗原或抗体是否存在及其量的多少抗原或抗体是否存在及其量的多少实验原理：实验原理：3ELISA的测定方法包括：的测定方法包括：双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法间接法：检测抗体最常用的方法间接法：检测抗体最常用的方法竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体生物素－亲和素系统生物素－亲和素系统ELISA法：是在法：是在ELISA中引入生物素或亲中引入生物素或亲和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。

和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法4直接法直接法间接法间接法56BAS-ELISA 底物底物1.已知已知Ab包被固相包被固相2.加待检标本加待检标本3.加生物素标记的特异性抗体加生物素标记的特异性抗体4.加酶标记的亲和素加酶标记的亲和素5.加底物显色加底物显色亲和素亲和素酶酶生物素生物素待检标本待检标本biotin-avidin-system，生物素，生物素-亲和素系统亲和素系统此法敏感性更高用于抗原抗体以及此法敏感性更高用于抗原抗体以及DNA、、RNA的检测7材料和试剂：材料和试剂：1. HBsAg、包被液2.待检人血清待检人血清3.酶标记的抗酶标记的抗HBsAb抗体4.HBsAb阳性对照血清、阳性对照血清、HBsAb阴性对照血清阴性对照血清5.洗涤液：洗涤液：PH7.4　　0.01mol/L PBS-吐温吐温206.底物溶液：底物溶液：OPD-H2O2或或TMD-H2O27.终止液：终止液：2mol/L H2SO48. 酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪 酶酶标标板板移移液液器器酶标仪酶标仪8操作步骤：1.包被包被：将：将HBsAg用包被液作适当稀释（用包被液作适当稀释（1：：100），在），在96孔反应板中每孔加孔反应板中每孔加100μl，置，置37℃℃2h后再移置后再移置4℃℃过过夜。

夜2.洗涤：将洗涤：将96孔反应板倾去包被液，用洗涤液孔反应板倾去包被液，用洗涤液PBS-吐温吐温20加满各孔，置加满各孔，置3min,倾去，如此反复倾去，如此反复3次前两步次前两步已完成已完成）） 91.1.已知抗原包被酶标板已知抗原包被酶标板2.12.1弃去板内包被抗原弃去板内包被抗原2.22.2拍干拍干2.32.3加满洗涤液（重复三次）加满洗涤液（重复三次）103.3.加样加样（（1））阳性对照阳性对照：第：第1、、2孔加孔加HBsAb阳性对照血清阳性对照血清50μl；；（（2））阴性对照阴性对照：第：第3、、4孔加孔加HBsAb阴性对照血清阴性对照血清50μl；；（（3））空白对照空白对照：第：第5孔加生理盐孔加生理盐水水100μl；；（（4）余下各孔加）余下各孔加待检血清待检血清50μl114.加加酶标记的抗酶标记的抗HBsAb抗体抗体：：除空白对照外除空白对照外各孔各孔50μl，充分，充分混匀将即时帖覆盖于反应板上，混匀将即时帖覆盖于反应板上，37℃℃孵育孵育30min5.弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置30秒、秒、再拍干，重复洗涤再拍干，重复洗涤5 次。

次操作同操作同2)6.显色显色：各孔（包括空白对照）加底物：各孔（包括空白对照）加底物A液液50μl（（1滴），底物滴），底物B液液50μl（（1滴），置滴），置37℃℃避光避光温育温育15min7.终止反应终止反应：各孔加终止液：各孔加终止液50μl （（2mol/L H2SO4 ）8.比色比色：将反应板以酶标仪：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔处用空白孔调零，测各孔OD值 126.显色显色各孔（包括空白对照）加底物各孔（包括空白对照）加底物A液液50μl（（1滴），底物滴），底物B液液50μl（（1滴），置滴），置37℃℃避光温育避光温育15min7.终止反应终止反应各孔加终止液各孔加终止液50μl （（2mol/L H2SO4 ））13OPD（邻苯二胺）经酶（邻苯二胺）经酶作用后的显色反应作用后的显色反应终终止止前前　　　　终终止止后后TMB四甲基联苯胺经酶作四甲基联苯胺经酶作用后的显色反应用后的显色反应终终止止前前　　　　终终止止后后14结果判断：u计算：计算：判断值＝阴性对照平均判断值＝阴性对照平均OD值值×2.1u结果判断：待测样品孔结果判断：待测样品孔OD值值大于或等于判断值为阳性大于或等于判断值为阳性；；　　　　　　　　　　　　小于判断值为阴性小于判断值为阴性。

注：阴性对照注：阴性对照OD值小于值小于0.05按按0.05计算，计算，　　大于　　大于0.05按实际按实际OD值计算判断值值计算判断值 15注意事项：1.试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀，试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀，弃去弃去1～～2滴垂直滴加；滴垂直滴加；2.严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性；严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性；3.应尽量避免孔中有气泡，以免所测得应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确值不准确 16思考题：1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？17182009级医疗专科复习题一、名词解释一、名词解释2.5*8,2.5*8,共共2020分分 免疫、抗原、抗原决定基免疫、抗原、抗原决定基( (表位表位) )、异嗜性抗原、白细、异嗜性抗原、白细胞分化抗原、胞分化抗原、TD-AgTD-Ag、、 TI-AgTI-Ag、、抗体抗体、、免疫球蛋白免疫球蛋白、、单（多）单（多）克隆抗体克隆抗体、、补体补体、经典途径、旁路途径、、经典途径、旁路途径、细胞因子细胞因子、、ILIL、、IFNIFN、、CSFCSF、、TNFTNF、、MHCMHC、、MHCMHC限制性、限制性、TCRTCR、、BCRBCR、、模式识别受体模式识别受体（（PRRPRR）、抗原提呈细胞）、抗原提呈细胞（（ APCAPC）、适应性免疫应答、免疫）、适应性免疫应答、免疫耐受、免疫调节、耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动免疫、超敏反应、人工主动免疫、人工被动免疫、计划免疫计划免疫注：红色标记为要求掌握英文19二、填空题（二、填空题（0.5×40=200.5×40=20分）分）三、单项选择题（三、单项选择题（1×30=301×30=30分）分）201.1.免疫的三大功能及其生理和病理表现。

免疫的三大功能及其生理和病理表现2.2.影响抗原免疫原性的因素影响抗原免疫原性的因素3.3.医学上有哪些重要的抗原医学上有哪些重要的抗原4.4.简述简述IgIg的基本结构的基本结构5.5.免疫球蛋白有哪些主要的生物学功能？免疫球蛋白有哪些主要的生物学功能？6.6.简述补体的组成简述补体的组成7.7.补体活化三条途径的比较补体活化三条途径的比较8.8.补体有哪些主要生物学功能？补体有哪些主要生物学功能？9.9.细胞因子有哪些共同的特性？细胞因子有哪些共同的特性？10.10.细胞因子的主要生物学作用细胞因子的主要生物学作用简答简答5×2=102111.11.简述简述MHCMHC分子的结构及其分布分子的结构及其分布12.12.HLAHLA的主要生物学功能的主要生物学功能13.13.T T细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子14.14.B B细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子15.15.巨噬细胞的主要生物学功能巨噬细胞的主要生物学功能16.16.简述免疫应答的基本过程简述免疫应答的基本过程17.17.抗原的提呈途径（两条）。

抗原的提呈途径（两条）18.18.固有免疫的组成及其与适应性免疫的关系固有免疫的组成及其与适应性免疫的关系19.19.两种人工免疫的主要区别预防接种的注意事项两种人工免疫的主要区别预防接种的注意事项20.20.灭活疫苗与减毒活疫苗的主要区别灭活疫苗与减毒活疫苗的主要区别22论述题（论述题（10×2=20））•免疫应答：免疫应答：　如　如TDTD抗原诱导体液免疫应答的过程；抗原诱导体液免疫应答的过程；　　　　TDTD抗原诱导细胞免疫应答的过程抗原诱导细胞免疫应答的过程•超敏反应：超敏反应：　四个型别超敏反应的发生机制及相关的防治原　四个型别超敏反应的发生机制及相关的防治原则，主要在则，主要在1 1和和2 2型。