甲状腺功能亢进对家兔眼轮匝肌影响.pdf

山西岳拜大学焉士掌位论文材料与方法1 ．材料：I ．I 实验动物和分组成年健康家兔l O 只，体重2 ．5 - - - - - 0 ．4 k g ，雌雄不限由山西医科大学实验动物中心提供1 0 只家兔随机分为2 组，每组5 只，即A 组( 单纯甲状腺功能亢进组) ；B 组( 对照组) 1 ．2 实验试剂及配制实验试剂3 ，5 ，3 ’．三碘甲状腺氨酸( T 3 )1 0 0 m gS I G M A 公司T 6 3 9 7 ：肌球蛋白重链单体．f ( M H C ．f ) 抗体O ．I m lN o v o c a s t r a 公司可与M H C - Ⅱ型结合N C L - M H C f ．肌球蛋白重链单体．s ( M H C ．s ) 抗体O ．1 m lN o v o c a s t r a 公司可与M H C - I 型结合N C L - M H C s ；肌球蛋白重链单体- n ( M H C ．n ) 抗体O ．1 m lN o v o c a s t r a 公司可与M H C ·新生儿型结合N C L - M H C n ；免疫组化试剂盒( H i s t o s t a i n - P l u sK i t )6 0 片晶美生物工程有限公司分装L H K 6 1 1 - 0 6 0 ( 抗小鼠) ；牛血清白蛋白( B S A ) l o g南京凯基生物K G Y 0 0 8 - 1 0 ；阿利新蓝8 G X ( A l c i a nb l u e ，8 G X ) l g生工生物工程( 上海) 有限公司分装A M R E S C O 公司A 0 2 9 8 ；F T 3 放射免疫分析药盒北京北方生物技术研究所；F T 4 放射免疫分析药盒北京北方生物技术研究所；T S H 放射免疫分析药盒北京北方生物技术研究所；T R A b 放射免疫分析药盒协和医药科技有限公司；M a y o r ’苏木素1 2 I n l博士德生物工程有限公司分装S I G M A 公司A R 0 0 0 5 ：吐温．2 0 ( T w e e n - 2 0 )l La o w e i - w a c a y 公司T 7 3 7 4 )防脱载玻片5 0 片博士德生物工程有限公司A R l 0 6 5 ：3 ％过氧化氢5 0 0 m l天津市化学试剂三厂；多聚甲醛5 0 9上海西巴斯生物技术开发有限公司分装M e r c k 公司；氯化钠( N a C L )5 0 0 9 分析纯天津市化学试剂三厂；氯化钾Ⅸc L )5 0 0 9 分析纯天津市化学试剂三厂；磷酸氢二钠( N a 2 H P 0 4 ·1 2 I - 1 2 0 )5 0 0 9 分柝纯天津市化学试剂三厂：磷酸二氢钾( K H 2 P 0 4 ·2 H 2 0 )5 0 0 9 分析纯天津市化学试剂三厂；枸椽酸三钠( C 6 H 5 N a 3 0 7 “ 2 H 2 0 )5 0 0 9 分析纯天津市化学试剂三厂；2山西医辩大学鼍士学位论文枸椽酸( C 6 I - 1 8 0 7 “ H 2 0 )等渗盐溶液( R i n g e r 液)冰乙酸缓冲液的配制5 0 0 9 分析纯5 0 0 r I l l5 0 0 m 1 分析纯天津市化学试剂三厂；浙江济民制药有限公司；中国中邦化工厂( 上海) 。

磷酸盐缓冲液( P B s ) ：磷酸氢二钠( N a 2 H P 0 4 ·1 2 H 2 0 ) 1 ．4 4 9 ，磷酸二氢钾( 1 矾P 0 4·2 H 2 0 ) 0 ．2 4 9 ，氯化钠( N a C L ) g g ，氯化钾( K C L ) 0 ．2 9 ，加入去离子水8 0 0 m l 中，调节P H7 ．2 0 ．4 ，加至总量1 0 0 0 m l ；枸椽酸盐缓冲液( C i t r a t e ) ：1 0 0 0 m l 蒸馏水中加枸椽酸三钠( C 6 H s N a 3 0 T “ 2 H 2 0 ) 3 9 ，枸椽酸( C 6 H 8 0 7 ·H 2 0 ) 0 ．4 9 ，P H6 ．O ；4 ％中性福尔马林液：多聚甲醛8 9 ，加P B S 液5 0 0 m l 加热( 6 0 ．8 0 “ 1 2 ) ，使多聚甲醛完全溶解呈清亮状，室温下冷却1 ．3 实验器材图像分析系统：M I A S ．2 0 0 0 图像分析系统四) r l JJ I 大智胜软件股份有限公司；放射免疫分析系统：S N ．6 9 5 B 型放射免疫y 计数测量系统上海核所日环光电仪器有限公司；离心机：恒温离心机德国H E R M L E 公司造Z K 3 6 5 ；电子精密天平：B S ．1 2 4 8北京赛多利斯仪器系统有限公司；兔箱、局部灯、注射器5 m l 、试管、碘伏。

2 ．实验方法2 ．1 甲状腺功能亢进动物模型的建立使用I MN a O Hl m l 溶解1 0 0 m g T 3 粉剂，R i n g e r 液稀释，并将液体P H 值调到7 ．2 —7 ．4 ，最终配制成浓度为0 ．1 m g ／m l 的B 稀释液A 组( 单纯甲状腺功能亢进组) ：助手固定家兔，使其腹部朝上，头低腹高位碘伏消毒注射部位，于家兔后腹部腹白线旁l e n a 进针，由实验动物产生临床甲亢的标准实验设计剂量O ．2 m g ／k g ．w t 给予腹腔注射T 3 稀释液，隔日一次，共一月家兔食量、水量不予以控制每日观察各项甲亢指标：体重、食物摄入、水量摄入、腹泻及兴奋性B 组( 对照组) ：隔日腹腔注射2 m l ／k g ．w t 的R i n g e r 液，共1 月2 ．2 甲亢动物模型评估：甲亢体征监测体重指标：于每早喂食、喂水前称量体重，记录血清学指标分别于给药前、给药l 周、2 周、4 周及处死前于家兔耳缘静脉采血5 m l ，离心取上清液，测定血清F T 3 、F T 4 、T S H 、T R A b 浓度2 ．3 病理学标本制作腹腔注射T 3 液1 月，空气栓塞法处死动物，迅速取双眼上脸标本，置于4 ％中性福尔3山西医辩大学焉士掌位论史马林液中固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋。

4pm 连续切片，切面为上睑横截面H E 染色将石蜡切片置于6 0 1 2 烤箱烤片l 小时，防止脱片常规脱蜡至水，苏木素染液染色5 m i n ，水洗；盐酸酒精分化2 0 s ，水洗；O ．5 ％伊红复染2 m i n ，常规脱水、透明、封片阿利新蓝染色将阿利新蓝( 8 G X ) l g 溶于1 0 0 m l 的3 ％冰乙酸中将石蜡切片置于6 0 ℃烤箱烤片l小时常规脱蜡至水，阿利新蓝染色2 0 m i n ，流水冲洗2 m i n ，蒸馏水漂洗，M a y o r 苏木素复染，水洗，脱水透明，封片免疫组织化学染色将经防脱处理的石蜡切片置于6 0 ℃烤箱中烤片过夜，使切片紧密粘附；切片常规脱蜡至水：热修复抗原：将切片浸于0 ．0 1 M 枸椽酸盐缓冲液( P H 6 ．O ) ，微波炉加热至沸腾后断电，间隔1 5 r a i n 后重复一次，室温下冷却后用O ．1 M 的P B S 洗涤2 次；滴加3 ％过氧化氢，室温4 0 m i n ，灭活内源性过氧化物酶，P B S 洗涤2 m i n X 3 次；滴加1 0 ％正常山羊血清封闭液，室温3 0 m i n ，甩去多余液体，不洗：滴加一抗( 使用I ％B S A 稀释，滴度分别为：M H C - f 1 ：2 0 ，M H C ．s l ：4 0 ，M H C - n 1 ：2 0 ) ，4 。

C 湿盒内过夜，P B S 洗涤2 m i n X 3 次；滴加生物素化二抗，3 7 ℃孵育半小时，P B S 洗涤2 m i n X 3 次；滴加H R P 标记链亲合素，3 T C 孵育3 0 m i n ，使用0 ．1 ％T w e e n - 2 0P B S 洗涤4 m i n X 3 次；D A B 染色5 ．1 0 m i n ( 镜下判断) ，自来水充分冲洗3 0 m i n ，蒸馏水漂洗2 r a i n ×3 次；M a y o r 苏木素复染5 m i n ，自来水充分冲洗；常规脱水、透明、封片3 ．图像学分析使用M I A S - 2 0 0 0 图像分析系统对免疫组化染色切片进行分析，测定各肌纤维的数量的变化、对不同M H C 进行分类计数4 ．统计学分析应用S P S S l 3 ．0 统计软件对体重、血清激素测量数值进行重复测量方差分析( 时间与组别二因素) ，对图像分析结果进行t 检验所有参数均以趸±s 表示P ≤O ．0 5 认为差异有显著性4山西压并大学焉士学位论文结果1 ．体重由实验组家兔体重一时间关系曲线、二组动物体重一时间变化曲线对比图( 如图1 ．1 、l - 2 示) 可以看出，A 组家兔体重随时间明显下降，而B 组家兔的体重则有增加。

对二组动物体重变化进行重复测量方差分析( 时间与组别两因素) ，可以认为A 组与B 组间体重变化存在显著性差异( P O ．0 5 ) A 组与B 组间存在显著性差异( P O ．0 5 ) A 组与B 组间存在显著性差异( P 0 ．0 5 ) A 组与B 组间存在显著性差异( P O ．0 5 ) ，二组动物血清T R A b 浓度间无显著性变化( P > O ．0 5 ) 3 ．1 H E 染色图3 ．1 为眼轮匝肌横截面H E 染色，图中可见，A 组与B 组相比肌细胞形态无明显改变，细胞间质中未见明显的炎性细胞浸润改变，水肿和纤维化改变( X1 0 0 ) 3 ．2 阿利新蓝染色：图3 - 2 为家兔眼轮匝肌病理切片阿利新蓝染色，图中可见，A 、B 组动物细胞间结缔组织内无明显的葡聚糖胺( G A G ) 类物质大量沉着( X1 0 0 ) 3 3 免疫组化染色及图像分析结果肌球蛋白重链( M H C ) 单体免疫组化染色图3 ．3 为轮匝肌肌球蛋白重链( M H C ) 单体免疫组化染色，由图片可见，在针对三种M H C 单体单克隆抗体的免疫组化反应中，A 组M H C ．s 染色阳性肌纤维与B 组相比数量增多，M H C - f ．M H C - n 染色阳性肌纤维数量有不同程度的减少( X1 0 0 ) 。

免疫组化病理图像分析结果使用M I A S ．2 0 0 0 图像分析系统对A 、B 组眼轮匝肌三种M H C 单体免疫组化染色病理图像进行分析，对每一张切片分别采集三帧图像，比较二组肌纤维数量及组成的变化，结6山西医再大学焉士学位论文果如下：表3 - l 家兔眼轮匝肌肌纤维数量A 组B 组注：各组所测定的肌纤维总数为三种M H C 单体免疫组化染色阳性肌纤维的总和由表3 ．1 、图3 - 4 可见( - - 组家兔眼轮匝肌肌纤维数量进行t 检验) ，所测定的二组眼轮匝肌肌纤维数量存在具有统计学意义的显著性差异( P I I A > I ，其中M H C- I I A 含量与年龄呈反比I 堋P e t t e D 等认为骨骼肌是由多种快慢肌纤维型和亚型组成的高变异性组织此外，肌纤维可调节自己以适应功能的改变在某一特定情况下，可发生快一慢或慢一快的转变【2 5 l 在对大鼠骨骼肌肌原纤维A T P 酶活性与M H C 的相关性研究中发9。