酵母双杂交实验步骤.doc

LexA 酵母双杂交系统简介一、LexA 酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒 p8op-LacZ 的 GAL4 UAS 编码序列被完全去除，因此在缺乏 LexA 融合激活剂的 情况下，报告基因 LacZ 的转录活性为零，该基因的筛选标志为 URA3，可以作为有自主复 制能力的质粒存在于酵母 EGY48 菌株中，也可以被整合到 EGY48 基因组 DNA 上 质粒 pLexA 的筛选标志为 HIS3，在双杂交系统中用于表达 DNA-BD(202 个氨基酸残基组 成的 LexA 蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子 ADH1 的调控，选择与报告基因的操纵子 LexA×8 结合 质粒 pB42AD 的筛选标志为 TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I 与 Xho I)上 游，含有 SV40 核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及 AD(来自于 E.coli 的 88 个氨 基酸残基组成的 B42 蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成 份 在酵母 EGY48 的基因组中还整合有另一个报告基因 Leu，它与 LacZ 报告基因具有相同的 操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有 DNA-BD 和 AD 的活性，即可激活报告 基因的转录和表达分别将待测蛋白 X、Y 的编码序列插入 pLexA 质粒载体和 pB42AD 质 粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白 X 与 Y 能相互 作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋 白 X、Y 是否具有相互作用以及作用的强弱 如果将蛋白 Y 换为取自组织或血液的 cDNA 文库，则可用 X 从该文库中筛选出能与其相互 作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的 cDNA二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA 文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ） 、YM4271（EGY48 的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8 株 4. 对照质粒：质 粒 用 途 pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照 pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD 融合蛋白〕 阳性对照 pLexA-Lam(LaminC 蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒 5. 引物： pLexA 测序引物及 pB42AD 测序引物。

三、酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因 p8op-LacZ 转化酵母 EGY48 菌株，用培养基 SD/-Ura 筛选 2. 同时构建或扩增 DNA 文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞 3. 构建 DNA-BD/靶蛋白质粒 pLexA-X，作为钓饵(bait) 4. 将上述钓饵质粒 pLexA-X 转化 EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用 SD/-His/-Ura 筛选；并用 固体诱导培养基 SD/Gal/Raf/-His/-Ura 检测此 DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基 因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明(含有 Gal/Raf) pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝 阳性对照 pLexA SD/-His，-Ura 白 阴性对照 PlexA-X SD/-His，-Ura 白 没有直接激活活性 PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝 具有直接激活活性 PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性4-1. 如果 pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。

能够自动激活报告基因，则设法去除其激活 活性部位、或者将 LacZ 报告基因整合入基因组，减少 4-2. 如果 pLexA-X 虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化 的文库 DNA 同时转化酵母5. 如果 pLexA-X 既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库 DNA 同 时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率转 化 质 粒 SD 固体培养基 LacZ 表型 对照 1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝 对照 2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝＋pB42AD-T 实 验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测＋pB42AD-文库 5-1. 用 SD/-His/-Trp/-Ura 培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导 前达到最大拷贝数 -半乳糖苷酶无表达5-2. 上述重组子转至含 X-gal 的固体诱导培养基 SD/Gal/Raf/-His/- Trp/-Ura/-Leu，观察 LacZ 及 Leu 报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。

白色克隆为假 阳性，说明 Leu 虽有表达，但 5-3. 同时用 LacZ、Leu 两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如： AD 融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况由于 2 个报告 基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了 5-4. 将蓝色阳性克隆进行 1 次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒6. 阳性克隆的筛选 6-1. 随机选取 50 个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化 E.coli KC8 宿主菌，抽提大肠 杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒 6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取 50 个阳性克隆来分析最后得到数种片段大小不同 的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有 AD-文库杂合子的克隆 7-1. 将初步得到的阳性克隆接种 SD/-Trp/-Ura 液体培养基，培养 1-2 天，含有 HIS3 编码 序列的 BD-靶质粒在含有外源 His 培养基中，将以 10％-20％左右的频率随机丢失。

C 孵育 2-3 天7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基 SD/-Trp/-Ura，30 7-3. 再挑取生长的单克隆，转入 SD/-Trp/-Ura 和 SD/-His/-Trp/-Ura 培养基中，筛选 His表型缺陷的克隆，即得到只含有 AD-文库杂合子的重组子 7-4. 将 His 表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基 SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证 AD-文库 能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆 如下表所示，在酵母 EGY48 及其对应的 YM4271 宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库 DNA，通过杂合实验确筛选 pLexA-靶 DNA 与 pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克 隆质粒 1 (in YM4271) 质粒 2 (in EGY48) LacZ 表型 Leu 表型 pLexA pB42AD 白 不能生长 pLexA-靶 DNA pB42AD 白 不能生长 pLexA pB42AD-文库 白 不能生长 pLexA-靶 DNA pB42AD-文库 蓝 真 阳 性 pLexA-Lam pB42AD-文库 白 不能生长9. 阳性克隆的进一步筛选和确证 9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母 DNA。

该 DNA 为混合成份，既含有酵母基因组 DNA，也含有 3 种转化的质粒 DNA 9-2. 将上述 DNA 电转化 E.coli KC8 宿主菌由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序 列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选因此，在 M9/SD/-Trp 培养基上，只有含有 AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒 DNA，酶切鉴定 9-3. 用 pLexA-靶 DNA 与 pB42AD-库 DNA 一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌 EGY48 中，先到 SD/-His/-Trp/-Ura 板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因 的表达与诱导 AD 融合蛋白的表达有关，再确证 LacZ、Leu 报告基因的表达 9-4. 扩增与靶 DNA 相互作用的文库 DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究 10-1. 用不同的双杂交系统验证 10-1-1. 将载体 pLexA 与 pB42AD 互换后进行双杂交实验 10-1-2. 选择不同的双杂交系统，如：以 GAL4 转录激活子为基础的双杂交系统 10-1-3. 将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。

-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化10-1-4. 去除或突变特定结合位点，定量检测 10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的 DNA 序列，证明其编码区域 10-3. 用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之 间的具有相互作用 10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系构建于 AD 载体的 cDNA 文库的扩增1. 自-80℃冰箱取出含有 cDNA 文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻 2. 用新鲜的 LB 培养液在 1.5ml 离心管中将上述甘油菌 1:106 和 1:108 稀释ll 加入 903. 取稀释菌液各 10 90mm)；37℃倒置培养过夜或 30℃培养 24-36hr，计数平板 上单克隆菌落数LB 培养液在 1.5ml 离心管中振荡混匀，涂布 LB/Amp 平板( 4. 确定待扩增的 cDNA 文库滴度(cfu/ml)=克隆数×108(1:106 稀释)或克隆数×1010(1:108 稀 释) 5. 按照>150mm)，共 100 块；37℃倒置培养过夜2-4×104cfu/平板的浓度，涂布 LB/Amp 平板( 6. 在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量 LB 培养液，将菌落刮下，转入 2000ml LB/Amp 培养液中，37℃振荡培养 2-4hr。

7. 留取适量培养菌液以 50%无菌甘油稀释至 25%终浓度，分装，保存于-80℃ 8. 其余培养菌液离心 8000xg×10min，4℃收集细菌；用质粒 DNA 纯化试剂盒大量抽提质 粒 DNALB 液体培养基，121℃，15lb/in2 灭菌 15minA. bacto-Tryptone 10.0g B. bacto-Yeast Extract 5.0g C. NaCl 10.0g D. ddH2O → 1000 ml * LB 固体培养平板为含有 1.5%琼脂(Agar)LB 培养基 ** LB/Amp 培养基为含有 Amp g/ml 的 LB 培养基50-100构建于 AD 载体的 cDNA 文库的纯化1. 质粒 DNA 提取缓冲液名 称 缓 冲 液 配 方 g/ml RNaseP1 悬浮缓冲液 50mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA；100 A P2 裂解缓冲液 200mM NaOH；1% SDS P3 中和缓冲液 3.0M Kac(pH5.5) QBT 平衡缓冲液 750mM NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇；0.15% Triton X-100 QC 洗涤缓冲液 1.0 M NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙。