生化实验三 组织匀浆的制备方法和琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察.ppt

实验三实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察血液样品的处理与血液样品的处理与组织匀浆的制备组织匀浆的制备(1)学习血液样品的处理与组织匀浆的方法2)学习离心机的使用方法3)进一步理解酶的竞争抑制原理实验目的：实验目的：实验原理琥珀酸脱氢酶催化底物琥珀酸脱氢生成产物延胡索酸，同时脱下来的氢在有氧的情况下经过一系列的传递体最后传给氧而生成水本实验设计在无氧的条件下使底物脱下来的氢交给氧化型的受氢体甲烯蓝（蓝色）使之成为还原型受氢体甲烯白（无色），通过观察蓝色到无色的变化从而了解脱氢酶的活性HOOC—CH2—CH2—COOHHOOC—CH=CH—COOHFADFADH2MBH2甲烯白（无色）MB甲烯蓝（蓝色 ）在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢 酶活性的改变• 琥珀酸脱氢酶竞争性抑制作用竞争性抑制作用抑制剂(I)与底物(S)的结构相似，能与底物 竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形 成，使酶的活性降低这种抑制作用称为竞争性 抑制作用• 反应模式 +I IE EI IE + SE + SE + PE + PESES[S]>>[I]：高浓度的底物可解除抑制竞争性抑制作用特点竞争性抑制作用特点1、I结构常与S结构类似2、I/S与酶的结合部位相同:酶的活性中心3、[S]↑可以降低甚至消除抑制作用4、(表观）Km值增大，Vm值不变实验器材与试剂实验器材与试剂: :（一）试剂n pH=7.4 磷酸缓冲液n 1.5% 琥珀酸钠溶液n 1% 丙二酸钠溶液n 0.02% 甲烯蓝溶液n 生理盐水n 液体石蜡实验器材与试剂：实验器材与试剂：（二）器材研钵、手术剪、手术镊子2 mL 移液管1000 uL微量可调仪器10 mL 离心管低速离心机等实验操作：实验操作：1. 琥珀酸脱氢酶酶液的制备 1 g 猪心匀浆浆上 清 液 （酶液）剪碎， 3-4ml 1/15mol/L Na2HPO4 6-7ml, 1/15mol/L Na2HPO4 2000r / min 离心10min 放置20min 细胞破碎 抽提 分离 2. 琥珀酸脱氢氢酶的作用及酶竞竞争抑制作用的观观察单单位：滴试试管号心脏脏提取 液琥珀酸钠钠 丙二酸钠钠 蒸馏馏水甲烯蓝烯蓝155-25225 (煮沸)5-25231055152410205-2混匀，立即加5-10滴液体石蜡封面置37 ℃ 和沸水浴，30min 内观观察各管颜颜色变变化结结果：各试试管颜颜色由蓝变蓝变 白速度快慢依次为为：？原因分析：1号？2号？3号？4号？• 1> 心脏一定要充分研磨至糊状，使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里• 2> 离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的离心管对称放置• 3> 离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免糜液重新变浑浊注意事项：注意事项：三、实验报实验报 告要求：• 原理琥珀酸脱氢氢酶催化的反应应、酶的竞竞争性抑制作用、本实验实验 脱氢氢酶活性观观察的原理。

• 操作（用表格表示）• 结结果• 结结果说说明思考题：思考题：• 1: 为为什么反应应开始后，反应应液必须须静止，不能再摇动摇动 ?• 2：抑制剂还剂还 可以选选用什么物质质？• 3：利用本实验实验 的数据，说说明酶竞竞争性抑制的特点？实验内容二实验内容二 血液样品的处理与血液样品的处理与组织匀浆的制备组织匀浆的制备•㈠ 血液和组织样品的采集在实验动物功能评价中，需要采集的生物样品主要是血液和组织脏器，它是反映受试物的生物学效应和物质在体内代谢情况的最为重要的途径• 1．采血 • 2．组织匀浆制备：将动物组织细胞在适当的缓冲液中研磨，使细胞破坏，细胞内容物溶解或悬浮于缓冲液中形成混悬液•㈡生物材料的处理• 1．血液样品 • ①全血：即抗凝血，主要用于Hb、RBC、WBC等一些生化指标的测定• ②血浆：抗凝血离心分离，除去细胞成分所得主要用于凝血、纤维蛋白和一些生化指标的 测定• ③血清：不加抗凝剂，自然凝固后析出的澄清淡黄色透明液体• 2．血液样品的区别 • ①血浆与血清的区别• 血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋原和前凝血酶• 血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋原和前凝血酶。

• ②全血一般用于血细胞分析，不宜作系列化分析生化分析一般用血清或血浆• 3．常用抗凝剂• ①EDTA—Na2 ：能较好地保存血细胞成分，可得较纯的细胞悬液对血细胞形态影响很小，适于血细胞分析• 常配成10%水溶液，2D（烘干）可抗凝5ml血液• ②肝素：常用Na盐或K盐，抗凝作用强，不影响细胞形态，对血液化学分析干扰少• 肝素抗凝血不宜作血细胞培养，不宜作纤维蛋白原测定，作DC时，染色性较差作血液量元素分析时慎用• 一般配成1%水溶液，取0.5ml于试管，37～50℃烘干，可抗凝5ml血液•㈢生物材料的制备 • 1．血浆制备： 自然分离：抗凝血置4℃冰箱，12h可使血细胞与血浆充分分离 • 离心分离：抗凝血以3000rpm，5-10min. • 保存：采血6h内从全血分离出的血浆在-18℃以下可保存12个 月• 2．血清制备： 采血后室温下自然凝固后即析出血清 • 冬季，采血后37℃水浴30min，可加快凝固 • 或将全血置4℃冰箱3-4h，再以1500～2000rpm 离心15’ ，上清液即为血清• 3．无蛋白血滤液制备 • 方法：• ①使蛋白质脱水沉淀：常用甲醇、乙醇、丙酮等有机试剂或（NH4）2SO4、Na2SO4，NaCl等中性盐类沉淀。

• ②有机酸沉淀剂：常用的有苦味酸，钼酸、磷钨酸、水杨酸及三氯醋酸等PH要稍低于Pr.等电点）• ③重金属离子沉淀：如Cd ++ 、Hg ++ 、Fe ++ 、Ca ++ 及Pb ++等PH要稍高于Pr.等电点）• 蛋白质沉淀后，离心除去蛋白质四．组织匀浆的制备（本实验操作内容）1、脑处死乌鳢，取组织（晶状体、心脏、肝脏、肾脏）（~1g），在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入研钵内2、用移液管量取预冷的匀浆介质（20%的蔗糖溶液）,1：3（操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的研钵放入冰水中）3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融4、将制备好的匀浆用低温高速离心机10000r/min离心40分钟，将离心好的匀浆取上清待分析检查最后将不同组织上清液分装成200ul/管，做好标记待分析！三、实验报实验报 告要求：• 血液样样品和组织组织 匀浆浆的制备备方法• 本实验实验 所采用组织组织 匀浆浆的操作方法思考题• 1. 血清与血浆浆的区别别？• 2. 制备备血清、血浆应浆应 注意哪些？• 3. 制备组织备组织 匀浆应浆应 注意什么？。