球孢白僵菌对苯并咪唑类杀菌剂抗性分子机理及遗传改良.pdf

摘要丝孢类杀虫真菌是害虫微生物防治的重要资源，球孢白僵菌( B e a u v e r i ab a s s i a n a )为典型代表用于作物害虫防治的生防真菌制剂一般都是以分生孢子为有效侵染体的活体制剂，在作物环境中会遇到防治作物病害而喷洒的化学杀菌剂而失活，尤其上世纪六十年代以来被广泛用于防治各种真菌性植物病害的苯并咪唑类杀菌剂因此，赋于生防真菌抗杀菌剂的特性是提高生防真菌制剂田间适应性和害虫防治效果的重要途径本研究从2 0 株野生球孢白僵菌分生孢子对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗性评价入手，开展了B b 2 8 6 0 菌株的化学诱变及其若干随机突变子D ．微管蛋白编码基因T U B l 的序列分析，比较了随机突变子的有丝分裂异常与抗逆性状的关联，进行了T U B l 的定点突变分析，分离出抗药性和耐热力的主要关联位点主要内容分述如下：p ．微管蛋突变导致的球孢白僵菌苯并咪唑类杀菌剂抗性及耐热力变化用含不同浓度多菌灵( o 的萨氏培养基( S D A Y ) 平板评价2 0 株野生球孢白僵菌对多菌灵的抗性将各菌株分生孢子在不同浓度多菌灵的平板上培养4 天后的菌落形成数和无药S D A Y平板上菌落形成数的比值，定义为分生孢子残存指数厶。

各菌株厶观察值分别拟合逻辑斯蒂方程I l ／[ 1 + e x p ( a + f l C ) 】( ，2 ≥0 ．9 3 ) 求解拟合的方程得出对各菌株的半致死浓度E C 5 0 和最小抑制浓度M I C ( 即抑菌9 9 ％的浓度E C 9 9 ) 结果显示，2 0 株野生菌除一株为低抗型外，其余对多菌灵均表现敏感根据各野生株的综合性状，选定B b 2 8 6 0 菌株进行亚硝酸钠处理的化学诱变，获得1 3 个随机突变子，其中2 个高抗突变子能拟合上述逻辑斯蒂方程( 龟o ．9 3 ) ，而其余1 1 个超高抗突变子只能拟合密度方程厶= 似- , a O - 1 压( r 2 之0 ．9 2 ) 所有1 1 个超高抗突变子对多菌灵的M I C > 1 0 0 0p t g ／r n L ，在B b 2 8 6 0 野生株的M I C ( = 1 ．3 2 “∥m L ) 提高7 5 8 倍以上经三次传代培养，所有随机突变子的抗性均稳定遗传，并且萌发率和产孢能力未受明显影响所有1 3 个突变子的分生孢子在4 8 “ C 下随热胁迫时间( f ) 衰变的残存指数厶也拟合逻辑斯蒂方私= l ／[ 1 + e x p ( a + f l t ) 】( 厂2 ≥0 ．9 7 ) 。

结果显示，突变子的半致死时f 司L T s o 介于1 ．8～9 ．6m i n 之间，远低于野生株的3 6m i n 对突变子的孢壁类疏水蛋白含量即可甲酸抽提的( F A E ) 孢壁蛋白含量进行测定后发现，诱变引起的孢子耐热力下降与F A E 含量并无关联，而其@ E C s o 1 0 0 ．0 为高抗( H R ) ．2 ．3 ．2 突变菌株对多菌灵的抗性已经开发成为防治刺吸式1 2 1 器害虫的制剂的野生菌株B b 2 8 6 0 ( F e n ge ta 1 ．，2 0 0 4 ；S h i & F e n g ，2 0 0 4 ；P ue ta 1 ．，2 0 0 5 ) ，由于对多菌灵表现高敏感( M I C = 1 ．3 2b t g ／m 1 ) ，因而选定其为抗多菌灵的诱变亲本第一轮诱变获得两株活力较好的转化子B b 2 8 6 0 m l 和B b 2 8 6 0 m 2 ，第二轮诱变以B b 2 8 6 0 m 2 为亲本，．fIl『I 广【广．广|暑I!工I．I，I1Z3455，5H1 01 12 8 6 0 - M 2m u I a n 恒图2 ．1 球孢白僵菌2 8 6 0 ．M 2 突变子系列在含多菌灵( 白栅：2 0 01 1 9 ／m l ；暗栅：1 0 0 0 ¨g ／m 1 ) 的S D A Y 平板上的残存指数．F i g ．2 ．1S u r v i v a li n d i c e so f 且b a s s i a n a2 8 6 0 一M 2m u t a n t so nS D A Yp l a t e sc o n t a i n i n gM B C ( w h i t eb a r s ：2 0 0l a g ／m l ；d a r kb a r s ：10 0 0I x g ／m 1 ) ．E r r o rb a r s ：S D ．共获得1 1 个突变子( 编号B b 2 8 6 0 m 2 —1 至B b 2 8 6 0 m 2 ．1 1 ) 。

所有突变子在无药S D A Y 平板上连续培养三代后，回复测定的抗药性具有遗传稳定性两株第一代突变子对多菌灵的抗性远大于野生亲本B b 2 8 6 0 m 1 在1 2 5“g ／r r d 的浓度下还能形成菌落，B b 2 8 6 0 I n 2 能够在5 0 “g ／r r d 的浓度下存活由拟合方程确定的M I C 值分别是野生菌株的6 0 倍和2 9 ．5 倍在以B b 2 8 6 0 m 2 为亲本的第二轮诱变中，获得的1 1 株突变子抗药性超强，已强至无法用多菌灵溶解于平板的方法测得其抗药性上限( 图2 ．1 ) 这些突变子厶．C 关系也无法用逻辑斯蒂方程拟合，但拟合密度方程很好( 皮o ．9 5 ；表2 ．2 ) 结果显示，第二代突变子的M I C 均大于1 0 0 0 ¨g ／m i ，5 株可以测得E C s o ，介于2 6 9 ．8 肛∥n d 与9 1 9 ．6p g ／r r a 之间，其余均超过1 0 0 0v ．g ／m l 这些数据说明，第二次诱变获得了超高抗多菌灵的B b 2 8 6 0 突变株2 ．3 ．3 球孢白僵菌突变子的耐热力野生菌株B b 2 8 6 0 及其突变子的孢子活力在4 8 ℃热胁迫下的残存指数变化均非常大。

最敏感的突变子B b 2 8 6 0 m 2 ．2 热激5m i n 就全部失活，而最耐热的野生亲本需要热激7 5m i n 才能完全失活而突变子和野生菌株的孢子残存指数( D 与热激时间( f ) 之间的关系均能够很好地拟合逻辑斯蒂方程( 如o ．9 7 ；表2 ．3 ) 野生菌株最耐热，其L T 5 0为3 6m i n ，而最敏感突变子B b 2 8 6 0 m 2 ．2 的L T 5 0 仅为1 ．8m i n 两株第一代突变子的L T 5 0 分别是1 4 ．4m i n 和2 2 ．4m i n ，而第二代突变子耐力热均较差，其L T s o 在1 0m i n 以下¨¨¨啦¨蕞|pu一面^I≯，∞表2 ．2B b 2 8 6 0 菌及其多菌灵抗性突变子对多菌灵的E C 5 0 和M I C ．T a b l e2 ．2T h eE C 5 0a n dM I Ce s t i m a t e so fB ．b a s s i a n a2 8 6 0a n di t sM B C - r e s i s t a n tm u t a n t sb a s e do nt h ef i to ft h e i rs u r v i v a li n d i c e s ( 厶) t oM B Cc o n c e n t r a t i o n s 【c ) o nS D A Yp l a t e s ．P a r a m e t e r se s t i m a t e df r o mm o d e l i n g4 E C ∞M I C M u t a n t s 口±S E口土S E五±S E，F ( d f l ，d f 2 )( p g ／m 1 )( p g ／m 1 )2 8 6 0w i l d- 2 ．7 6 6 ±O ．8 9 75 ．5 8 9 2 ±1 ．6 7 5 6⋯2 8 6 0 ．M l2 8 6 0 ．M 2- 3 ．4 9 l ：L 0 ．4 4 80 ．1 0 2 l ±0 ．0 1 2 8—5 ．3 2 7 士O ．5 7 60 ．2 5 4 3 士0 ．0 2 6 90 ．9 3 86 1 ( 1 ，4 )0 ．9 9 35 6 8 ( 1 ，4 )0 ．9 9 19 6 8 ( 1 ，9 )0 ．7 31 ．3 23 4 ．27 9 ．22 0 ．93 9 ．02 8 6 0 ．M 2 ．11 ．0 0 5 ±0 ．0 1 5- 4 ) ．0 0 0 8 ±0 ．0 0 0 0- 1 ．8 9 士0 ．1 90 ．9 9 61 0 9 0 ( 2 ，8 )9 1 9 ．6> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．20 ．9 9 7 i - 0 ．2 5 20 ．1 11 9 士0 ．0 8 ll1 2 ．1 2 + 9 ．1 7O ．9 6 21 0 0 ( 2 ，8 )> 1 0 0 0> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．30 ．9 7 4 ±0 ．1 0 80 ．0 0 3 2 5 ．' 0 ．0 0 2 44 ．1 0 ±1 ．8 20 ．9 3 86 1 ( 2 ，8 )> 1 0 0 0> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 - 41 ．0 0 3 i , 0 ．0 2 2O ．0 0 0 9 ：L - O ．0 0 0 80 ．6 0 ±- 0 ．4 30 ．9 7 11 3 4 ( 2 ，8 )5 7 3 ．7> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．50 ．9 5 0 - 士- 0 ．0 4 6—0 ．0 0 0 8 土0 ．0 0 0 1一1 ．2 4 土0 ．3 20 ．9 7 41 5 2 ( 2 ，8 )6 5 8 ．7> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．61 ．0 4 7 i ' 0 ．0 2 2- 0 ．0 0 0 7 ±0 ．0 0 0 1- 6 ．6 9 + 9 ．110 ．9 8 52 4 5 ( 2 ，8 )> 1 0 0 0> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．70 ．9 4 4 ±0 ．1 2 70 ．0 0 9 7 ±0 ．0 0 4 37 ．6 7 ±1 ．5 20 ．9 6 71 1 5 ( 2 ，8 )> 1 0 0 0> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．81 ．0 3 2 i - 0 ．0 9 40 ．0 0 4 4 ：L , 0 ．0 0 2 46 ．3 0 ±1 ．8 4O ．9 6 410 7 ( 2 ，8 )> 10 0 0> i0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．91 ．1 0 2 ±0 ．1 9 20 ．0 0 9 0 士0 ．0 0 6 77 ．0 5 + 7 ．3 20 ．9 2 54 9 ( 2 ，8 )> 1 0 0 0> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．1 01 ．0 1 5 ±0 ．0 1 7- 0 ．0 0 0 7 土0 ．0 0 0 1一1 ．2 7 ±0 ．2 20 ．9 9 75 1 5 ( 2 ，3 ) 8 5 8 ．9> 1 0 0 02 8 6 0 ．M 2 ．1 11 ．0 0 2 ±0 ．0 2 40 ．0 0 6 8 i - - 0 ．0 0 1 71 ．5 0 - L - 0 ．2 00 ．9 9 87 3 9 ( 2 ，3 )2 6 9 ．8> 1 0 0 04 野生株2 8 6 0 ( M B C ：0 ．1 ．2 5I , t g ／m 1 ) 、突变子2 8 6 0 一MI ( M B C ：0 —1 2 5 唱／m 1 ) 和2 8 6 0 ·M 2 ( M B C ：O - 5 0 “∥m 1 ) 拟合逻辑斯蒂方程厶= l ／【l + e x p ( ∽】，其余2 8 6 0 一M 2 的突变子( M B C ：0 ·1 0 0 0 岖／m I )。