SephadexLH-20使用说明.docx

名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -技术文章Sephadex LH-20 使用说明Sephadex LH-20 使用说明1 Sephadex G 型葡聚糖凝胶只适合在水中使用， SephadexG-25 羟丙化后就是 SephadexLH-20 ；其既有分子筛作用， 在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中仍有反相层析成效；虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐；此外上柱样品 缺失很少，对处理小样品较好，这也是试验室常用的缘由之一；2Sephadex LH20的原理；SephadexLH20的分别原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相安排的作用（在反相溶剂中）；由于凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强， 最终出柱； 假如使用反相溶剂洗脱， SephadexLH20 对化合物仍起反相安排的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱；假如使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分别；3Sephadex LH20 洗脱溶剂；SephadexLH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种；用得最多的是反相溶剂洗脱， 以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐步增加甲醇比例，最终用 100 ％甲醇冲柱；正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用 50 ％氯仿－－甲醇，逐步增加甲醇比例，最终 用 100 ％甲醇冲柱；4Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的挑选；假如样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－水），样品用最少体积的甲醇－水（尽可能甲醇少一些） 溶解， 过滤后， 湿法上样 （肯定要滤！ 要是把 Sephadex LH20 堵啦，就得将 SephadexLH20 的柱头部分弃去） ；假如样品极性小， 这选用正相溶剂洗脱 （氯仿－甲醇），样品用最少体积的氯仿－甲醇溶解，过滤后，湿法上样；5Sephadex LH-20 的步骤；(1) 挑选条件：梯度洗脱在 Sephadex 使用中并不象在正相柱层析中那么重要； 第一你的样品必要能溶解在尽量少量的洗脱剂中；极性在的用甲醇水系统 ;极性小者一般用不含水的系统；我 们试验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，成效较好；(2) 饱和层析柱：用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中；至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中；(3) 样品处理：用完量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤；(4) 湿法上柱；这也是要有技巧的步骤；(5) 洗脱：掌握流速，一般 1drop/s 以下，可参见厂家的一些参数 ;必要时更换极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）；再生以备下次使用；6 分别的技巧（1） 流速不行太快，切切不行新急，所谓欲速就不达； 第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -（2）柱子尽可能长， SephadexLH20 柱长的增加将极大地改善分别，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱；（3） 馏分肯定要接的细，可 1／ 10 ，或 1／ 20 个保留体积接成一馏分；（4） 洗脱体积一般为 2-3 个保留体积， 对特殊保留强的化合物， 可洗脱 5 个保留体积；（5）鞣质成分死吸附严峻，不建议用 LH20 分鞣质；（6） SephadexLH20 对黄酮类成分的分别成效极佳，方法很成型，有大量文献参考；（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗洁净，然后用下一次分别的起步溶剂将甲醇替换出来，待用；Sephadex LH-20 是由葡聚糖 G-25 羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，特殊适用于自然产物在有机溶剂中的纯化；例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等， Pharmadex LH-20 同时适用于分子类别特别相像的物质的分别和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分别；制备凝胶悬浮液装填的重要原就之一就是需要形成一个稳固均一的柱床；胶颗粒越均一（粒径分布越窄），越简洁获得稳固均一的柱床；但是对于 Sephadex LH-20 而言， 25 ～100 μm 的粒径范畴相对于很多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽； 然而当胶溶胀后就相对简洁得到均一的柱床；这对于长柱 （最高至 250cm ）而言也是同样的；在装柱前，层析柱和储槽都必需进行完全的清洗；Sephadex LH-20 在使用之前必需进行溶胀；在溶胀的过程中，要尽量防止过分搅拌，否就会破坏球形胶粒，且要防止使用磁力搅拌器；1． 在室温下， 将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小打算于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表运算特定柱体积所需要干胶的量；2． 使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的 75% ，上层溶剂占 25% ，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动；3． 将溶胀后的凝胶依据装柱要求匀称倒入柱内， 在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过 1.5ba ；平稳上样前， 用洗脱液平稳层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止， 如转变溶剂应当留意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并依据性质确定柱高调剂器的位置， 如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平稳可以省略；洗脱液为确保延长层析柱的使用寿命，全部的缓冲液都应当离心或经过 0.45um 的膜过滤以除去杂质；样品样品体积应当占柱总体积的 1-2% ，同样在使用之前样品应当离心或经过 0.45um 的膜过滤；洗脱洗脱流速应依据情形而定，最大张性流速约 12cm/min （反压 1.5ba ），建议流速为 1-10cm/h ；总体来说，较低的流速，具有较高的分辩率； 第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -再生凝胶再生通常是先用 2-3 个柱体积的洗脱液进行清洗， 如更换洗脱液， 就需要重新平稳；体积流速与线性流速的关系线性流速 =体积流速 /横截面积溶胀体积由于 Pharmadex LH-20 的溶胀体积依靠于溶剂， 所以对于不同直径的柱可依据比例增加或削减旧柱体积以便运算出新体积；新体积 = 旧体积 ×（新柱体积 /旧柱体积）胶的性质Sephadex LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质， 且被分别物质的极性在分别过程中起着重要作用；排阻极限 4-5KD （与所用溶剂有关）上样量吸附模式 取决于所需分辩率分子量大小 小于总体积的 20%正相安排 小于总体积的 1%其他胶粒外形 球形，多孔颗粒大小（干） 18-111um （直径） 颗粒大小中间值（干） 70um （直径）颗粒大小（甲醇） 27-163 um （直径）颗粒大小中间值（甲醇） 103 um （直径）最大线性流速 720cm/min参考线性流速 60 cm/minpH 的稳固性操作中 2-11清洗中 2-13化学稳固性 在很多水溶液及有机溶剂系统中都稳固； 在 pH2 以下或强氧化剂中不稳固高压灭菌 121 ℃可忍耐 20 分种操作温度 4℃到 40 ℃储存条件新填料 4-25 ℃（干燥）使用后填料 4-8 ℃， pH6-8 切勿冷冻，加入抑菌剂（如 20% 乙醇 0.04% 叠氮钠）干胶溶胀表 第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -溶剂 床体积（ ml 凝胶 /g 干胶粉末）Dimethylsulphoxide 二甲亚砜 4.4～ 4.6Pyridine 嘧啶 4.2～ 4.4Water 水 4.0～ 4.4Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8～ 4.2Saline 生理盐水 3.9～ 4.1Methanol 甲醇 3.8～ 4.1Methanedichloride 二氯乙烷 3.8～ 4.1Chloroform* 氯仿 3.8～ 4.1Propanol 丙醇 3.7～ 4.0Ethanol** 乙醇 3.6～ 3.9Isobutanol 异丁醇 3.6～ 3.9Formamide 甲酰胺 3.6～ 3.9Methylenedichloride 二氯甲烷 3.6～ 3.9Butanol 丁醇 3.5～ 3.8Isopropanol 异丙醇 3.3～ 3.6Tetrahydrofuran 四氢呋喃 3.3～ 3.6Dioxane 二氧杂环已烷 3.2～ 3.5Acetone 丙酮 2.4～ 2.6Acetonitrile*** 乙腈 2.2～ 2.4Carbontetrachloride 四氯化碳 1.8～ 2.2Benzene 苯 1.6～ 2.0Ethylacetate 乙酸乙酯 1.6～ 1.8Toluene 甲苯 1.5～ 1.6* 包含 1%的乙醇** 包含 1%的苯*** 溶胀胶体积小于 2.5ml/g 的溶剂没有使用价值假如 Sephadex LH20 柱子被弄脏了，大多数情形下是由于样品没滤，将柱头堵住，或由于样品的死吸附（一般很少发生），使柱子的柱头部分污染，一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去， 详细做法很简洁， 只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起， 倒掉即可；假如柱子整个被污染，假如是将 Sephadex LH20 用反相被污染，方法如下：依次用水， NaOH-NaCl 水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子；由于是整个柱子被污染， 所以污染物肯定不会完全死吸附在柱上 （假如完全死吸附在柱上，污染物肯定会只在柱 头部分），所以用合适的溶剂肯定可以将之洗下来；在更换洗脱溶剂或进行调料再生时，需要特殊留意溶剂更换的梯度不行以太大，以防止柱层中显现气泡或镂空； 假如发觉柱层时样品色带的走行显现明显的速度不一样， 建议重装柱子；NaOH-NaCl 水溶液配法： 8g NaOH 、30g NaCl 、1000ml 水 第 4 页，共 4 页 - - - - - - - - -。