蛋白组学翻译后修饰ppt课件.ppt

蛋白质组学浙江大学浙江大学生命科学学院生命科学学院江江 辉辉第五章 蛋白质翻译后修饰的鉴定蛋白质的翻译后修饰蛋白质的翻译后修饰 n很多前体蛋白是没有活性的，经常要进展一个系列很多前体蛋白是没有活性的，经常要进展一个系列的翻译后加工，才干成为具有功能的成熟蛋白的翻译后加工，才干成为具有功能的成熟蛋白n加工的类型是多种多样的，普通分为四种：加工的类型是多种多样的，普通分为四种：nN-端端fMet或或Met的切除：原核生物的肽链，其的切除：原核生物的肽链，其N-端端不保管不保管fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶〔，大约半数蛋白由脱甲酰酶〔deformylase〕除去甲酰基，留下〕除去甲酰基，留下Met作为第一个氨作为第一个氨基酸；在原核及真核细胞中基酸；在原核及真核细胞中fMet或者或者Met普通都要普通都要被除去被除去 n二硫键的构成二硫键的构成n化学修饰化学修饰n剪切：很多的前体蛋白要经过剪切后方可成为成熟剪切：很多的前体蛋白要经过剪切后方可成为成熟的蛋白的蛋白 ，如胰岛素，如胰岛素蛋白质的翻译后化学修饰蛋白质的翻译后化学修饰n蛋白质翻译后修饰在生命体中具有非常重要的作蛋白质翻译后修饰在生命体中具有非常重要的作用，它使蛋白质的构造更为复杂用，它使蛋白质的构造更为复杂, 功能更为完善，功能更为完善，调理更为精细调理更为精细, 作用更为专注。

作用更为专注n化学修饰的类型也很多，包括磷酸化〔如核糖体化学修饰的类型也很多，包括磷酸化〔如核糖体蛋白的蛋白的Ser，，Tyr和和Trp残基常被磷酸化〕；糖基化残基常被磷酸化〕；糖基化〔如各种糖蛋白〕；泛素化〔要进入蛋白酶体降〔如各种糖蛋白〕；泛素化〔要进入蛋白酶体降解的蛋白〕；甲基化〔如组蛋白，肌蛋白〕，乙解的蛋白〕；甲基化〔如组蛋白，肌蛋白〕，乙酰化〔如组蛋白〕，羟基化〔如胶原蛋白〕等酰化〔如组蛋白〕，羟基化〔如胶原蛋白〕等 翻译后化学修饰的生物学效应翻译后化学修饰的生物学效应n泛素化对于细胞分化与凋亡、泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA 修复、免疫应修复、免疫应对和应激反响等生理过程起着重要作用对和应激反响等生理过程起着重要作用; n磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程;n糖基化在许多生物过程中如免疫维护、病毒的复制、糖基化在许多生物过程中如免疫维护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用; n脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用的作用; n组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调理有关。

组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调理有关蛋白质组学如何在翻译后蛋白质组学如何在翻译后化学修饰中发扬作用？化学修饰中发扬作用？n磷酸化磷酸化n糖基化糖基化蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化n磷酸化是经过蛋白质激酶将磷酸化是经过蛋白质激酶将ATP 的磷酸基转移到蛋的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程白的特定位点上的过程.n至少有至少有30%的蛋白被磷酸化修饰的蛋白被磷酸化修饰n大部分蛋白磷酸化是可逆的大部分蛋白磷酸化是可逆的n磷酸化的作用位点磷酸化的作用位点n真核生物的真核生物的Ser，，Thr，，Tyr 残基残基.n原核生物的原核生物的His，，Asp，，GluProtein + ATP protein-P + ADP激酶激酶蛋白质组学在磷酸化分析中的困难蛋白质组学在磷酸化分析中的困难n磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较低丰度的；低丰度的； n即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的其他磷酸化方式存在；除有该蛋白质的其他磷酸化方式存在； n细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处置时，这细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处置时，这些酶很容易将磷酸基团脱掉；些酶很容易将磷酸基团脱掉； n磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，由于其磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，由于其化学性质的负电性，在质谱技术中面临着难化学性质的负电性，在质谱技术中面临着难以质子化的困难。

以质子化的困难磷酸化蛋白质的检测磷酸化蛋白质的检测n32P放射性同位素法放射性同位素法n抗体免疫印迹法抗体免疫印迹法32P放射性同位素法放射性同位素法autoradiographyn -32P-ATP渗入培育渗入培育n蛋白样品的制备蛋白样品的制备n双向电泳双向电泳n检测检测n考染或者银染考染或者银染n放射自显影放射自显影n差别点分析差别点分析n检测检测放射性同位素法放射性同位素法n优点优点n灵敏灵敏n直观直观n局限局限n同位素污染，操作不方便同位素污染，操作不方便n假设磷酸化转换速率低，那么难以检测假设磷酸化转换速率低，那么难以检测n不能区分不同残基的磷酸化不能区分不同残基的磷酸化抗体免疫印迹法抗体免疫印迹法n蛋白样品的制备蛋白样品的制备n双向电泳双向电泳n检测检测n考染或者银染考染或者银染n免疫印迹〔磷酸化特异抗体〕免疫印迹〔磷酸化特异抗体〕n差别点分析差别点分析n检测检测抗体免疫印迹法抗体免疫印迹法n优点优点n灵敏灵敏n直观直观n抑制同位素法的局限抑制同位素法的局限n无同位素污染，操作相对方便无同位素污染，操作相对方便n可检测无磷酸化转换的蛋白可检测无磷酸化转换的蛋白n能区分不同残基的磷酸化能区分不同残基的磷酸化磷酸化肽段的分别和富集磷酸化肽段的分别和富集n运用磷酸化蛋白的抗体运用磷酸化蛋白的抗体 nIMAC法法n磷酸基团亲和取代磷酸基团亲和取代磷酸化蛋白的抗体磷酸化蛋白的抗体n目前曾经开发出针对特目前曾经开发出针对特异磷酸化位点的单克隆异磷酸化位点的单克隆抗体，抗体， -pTyr，，  -pSer，，  -pThrn利用这些单克隆抗体进利用这些单克隆抗体进展亲和纯化，可以分别展亲和纯化，可以分别和富集特定磷酸化的蛋和富集特定磷酸化的蛋白白固定金属鳌和亲和层析固定金属鳌和亲和层析(Immobilized metal affinity chromatography ，，IMAC) nIMAC技术是用于富集磷酸化的肽段，对磷酸化蛋白质的技术是用于富集磷酸化的肽段，对磷酸化蛋白质的富集是无效的。

富集是无效的 n利用了磷酸基团的负电性，与利用了磷酸基团的负电性，与IMAC柱上的带正电的金属柱上的带正电的金属离子结合，从而起到纯化的作用离子结合，从而起到纯化的作用nIMAC技术对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化都有效技术对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化都有效 nIMAC技术运用的金属离子主要是技术运用的金属离子主要是Fe3+、、Ga3+ 、、Cu2+等等n最主要的缺陷是特异性不强：最主要的缺陷是特异性不强：IMAC柱上的正电荷位点同柱上的正电荷位点同样会与肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合样会与肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合n对磷酸化肽段中的酸性残基进展了预先的甲基酯化，封锁对磷酸化肽段中的酸性残基进展了预先的甲基酯化，封锁了上述氨基酸的酸性侧链了上述氨基酸的酸性侧链IMAC填料－交联剂－金属螯合剂－金属离子MSMS/MS磷酸基团亲和取代磷酸基团亲和取代n将磷酸肽上的磷酸基团用另一种配基取代，将磷酸肽上的磷酸基团用另一种配基取代，再用亲和纯化的方法分别富集磷酸肽再用亲和纯化的方法分别富集磷酸肽n生物素取代生物素取代生物素取代生物素取代以以 -干酪素做测试干酪素做测试磷酸肽的识别磷酸肽的识别nMALDI－－TOF－－MS结合磷酸酶水解法结合磷酸酶水解法n磷酸酯酶处置蛋白质的前后，磷酸化肽段的质量数会有变化，比较前后磷酸酯酶处置蛋白质的前后，磷酸化肽段的质量数会有变化，比较前后图谱，寻觅质量数变化图谱，寻觅质量数变化80或或98Da和强度增大的信号就很能够是磷酸化肽和强度增大的信号就很能够是磷酸化肽段。

段n丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段的质量变化能够是丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段的质量变化能够是80Da，也能够是，也能够是98Da；酪；酪氨酸磷酸化肽段只需氨酸磷酸化肽段只需80Da的质量数变化的质量数变化 PSD－－MALDI－－TOF－－MSnPSD：源后衰变〔：源后衰变〔post-source decay〕，母离子在飞行中发生断裂，丧〕，母离子在飞行中发生断裂，丧失一个中性分子磷酸化肽段丧失失一个中性分子磷酸化肽段丧失HPO3或者或者H3PO4，产生质量数减少，产生质量数减少80kD或者或者98kD的子离子的子离子磷酸化位点确实定磷酸化位点确实定n用串联质谱〔用串联质谱〔MS/MS〕对磷酸化肽进展分析〕对磷酸化肽进展分析n将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断肽将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断肽序列和磷酸化位点序列和磷酸化位点n磷酸化位点产生丧失磷酸化位点产生丧失80kD或者或者98kD的子离子的子离子糖基化的蛋白质组学研讨糖基化的蛋白质组学研讨糖基化蛋白的生物学意义糖基化蛋白的生物学意义n在真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化在真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化 n蛋白质糖基化在蛋白质折叠、蛋白质定位和转运、蛋白质糖基化在蛋白质折叠、蛋白质定位和转运、蛋白质溶解性、抗原性以及细胞与细胞的相互作用蛋白质溶解性、抗原性以及细胞与细胞的相互作用等方面都有着重要的作用等方面都有着重要的作用 n细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白方式存在细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白方式存在n糖低聚物在细胞间信号传送中也起了重要的作用糖低聚物在细胞间信号传送中也起了重要的作用 n成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之一成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之一 n糖链比核酸和蛋白质在构造上更具有可变性，复杂糖链比核酸和蛋白质在构造上更具有可变性，复杂性性糖苷键类型糖苷键类型nN衔接：天冬酰胺序列子衔接：天冬酰胺序列子Asn-X-Thr/SernO衔接衔接:Ser/Thrn糖基磷脂酰肌醇锚糖基磷脂酰肌醇锚 (glycosyl phophotidylinositol, GPI)：通：通常是一些细胞膜蛋白或细胞壁蛋白，经过肌醇和细胞膜磷脂常是一些细胞膜蛋白或细胞壁蛋白，经过肌醇和细胞膜磷脂层结合层结合蛋白质糖基化研讨的根本目的蛋白质糖基化研讨的根本目的n寻觅编码糖蛋白的基因〔即基因组信息〕；寻觅编码糖蛋白的基因〔即基因组信息〕；n寻觅糖基化位点〔即糖基化位点信息〕；寻觅糖基化位点〔即糖基化位点信息〕；n解析糖链及糖基化肽段的构造〔即构造信息解析糖链及糖基化肽段的构造〔即构造信息〕；〕；n研讨糖基化的功能〔即功能信息〕研讨糖基化的功能〔即功能信息〕 蛋白质组学分析糖蛋白蛋白质组学分析糖蛋白n糖含量糖含量n糖苷键类型糖苷键类型n糖基化位点糖基化位点糖含量的测定糖含量的测定n比较糖苷内切酶作用前后糖蛋白的分子量比较糖苷内切酶作用前后糖蛋白的分子量核糖核酸酶核糖核酸酶B中糖基含量测定中糖基含量测定糖苷键酶糖苷键酶F作用前作用前糖苷键酶糖苷键酶F作用后作用后糖苷键酶糖苷键酶F：切断：切断N-衔接衔接五糖中心最内侧的五糖中心最内侧的GlcNAc-GlcNAc，剩一个，剩一个GlcNAc糖基化类型及其位点的分析糖基化类型及其位点的分析n糖苷内切酶和蛋白酶结合的方法糖苷内切酶和蛋白酶结合的方法n先用糖苷内切酶消化，再用蛋白酶消化，先用糖苷内切酶消化，再用蛋白酶消化，经过分析糖苷酶作用前后经过分析糖苷酶作用前后MS发生位移的肽发生位移的肽段，即可确定含糖基化的肽段段，即可确定含糖基化的肽段n结合串联质谱，可进一步分析糖基化肽段结合串联质谱，可进一步分析糖基化肽段的氨基酸序列，从而发现糖基化位点的氨基酸序列，从而发现糖基化位点核糖核酸酶核糖核酸酶B中糖基化位点的分析中糖基化位点的分析糖苷键酶糖苷键酶F作用前作用前糖苷键酶糖苷键酶F作用后作用后剩一个剩一个GlcNAc氨基酸序列的测定氨基酸序列的测定m/z=4792.23TSAASSSNYCNQMRQHMDSSTSAASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHE糖基化类型的分析糖基化类型的分析n糖蛋白进展蛋白酶切，得到含糖肽段，对肽段直接糖蛋白进展蛋白酶切，得到含糖肽段，对肽段直接进展进展ESI-MS/MS，以及，以及MALDI-TOF-MS的的PSD，，可以直接得到单糖碎片，从而确定糖链构造。

可以直接得到单糖碎片，从而确定糖链构造凝集素在糖蛋白研讨中的作用凝集素在糖蛋白研讨中的作用n凝集素是一类能和糖结合的蛋白，专注凝集素是一类能和糖结合的蛋白，专注识别某一特定构造的单糖或寡糖中特定识别某一特定构造的单糖或寡糖中特定的糖基序列并结合的糖基序列并结合n由于其专注性，不仅可以用于分别纯化，由于其专注性，不仅可以用于分别纯化，还可以用于构造分析还可以用于构造分析n伴刀豆球蛋白〔伴刀豆球蛋白〔ConA〕－〕－N-高甘露糖高甘露糖n麦胚凝集素〔麦胚凝集素〔WGA〕－杂合型〕－杂合型N-糖链糖链n兵豆凝集素－中心岩藻糖兵豆凝集素－中心岩藻糖。