脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数变异分析.docx

脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数变异分析王佶;安宇;周水珍;王艺;刘仁超【摘要】目的探讨运动神经元存活(SMN)1和SMN2基因拷贝数变异与脊髓性肌 萎缩症(SMA)患儿临床表型的关系•方法以2011年10月至2012年12月在复旦 大学附属儿科医院临床诊断SMA患儿为研究对象，采用基因组DNA多重连接探针 扩增(MLPA)技术进行SMN1基因缺失和SMN2基因拷贝数变异检测，探讨拷贝数 变异与SMA临床分型的关系•结果41例临床诊断SMA患儿行基因检测，其中 SMN1基因第7和(或)8外显子缺失37例(90.2%)进入分析，男女之比为1:0.&发病 年龄为(7.5±7.0)个月.1型20例(54.1%),口型15例(40.5%),皿型2例(5.4%),发病 年龄分别为(2.9±1.8)、(10.7±1.9)和(30.0±8.5)个月.37例SMN1基因第7和 (或)8外显子缺失患儿中,18例SMN2基因第7和8外显子拷贝数为2个，其中13 例(72.2%)为1型,5例(27.8%)为口型;19例SMN2基因第7和8外显子拷贝数增 加(拷贝数3或4),其中7例(36.8%)为I型,10例(52.6%)为口型,2 例(10.5%)为皿 型，两组差异有统计学意义.5例患儿父母行SMN1基因检测，共检出杂合缺失9例， 其中4例患儿父母均为SMN1基因第7和8外显子杂合缺失,1例患儿父亲为 SMN1基因第7和8外显子杂合缺失，母亲未检测到纯合或杂合缺失•结论SMN1 基因第7和(或)8外显子纯合缺失是SMA致病主要原因,SMN2基因拷贝数增加与 SMA 表型严重程度呈负相关.％Objective To study the relation between phenotype of spinal muscular atrophy( SMA ) in children and copy number variation of SMN1 and SMN2 gene. Methods Using genomic DNA multiplex ligation-dependent probe amplification ( MLPA ) the copy number variations of exon 7 and 8 of SMN1 and SMN2 were detected in children with clinically suspected SMA samples in Children's Hospital ofFudan University. Genotype and phenotype data were analyzed. Results The study covered 41 cases of children with suspected SMA. It included 37 cases ( 90. 2% ) with deletion of exon 7 and/or 8 of SMN1 gene, the ratio of male to female was 1 to 0. 8, the average age of onset was (7.5 ±7.0) months. There were type I 20 cases ( 54. 1% ), type 口 15 cases ( 40. 5% ), type 皿 2 cases ( 5. 4% ), the average age of onset of type I was ( 2. 9 ± 1.8 ) months, type 口 ( 10. 7 ± 1.9) months and type 皿(30. 0 ± 8. 5 ) months. In 37 patients with deletions in SMN1 gene, exon 7 and/or 8 had 2 copies in SMN2 gene in 18 cases, the average age of onset was ( 4. 9 ±3.9) months. 13 out of 18 cases ( 72. 2% ) were type I , 5 cases ( 27. 8% ) were type 口. There were 19 patients with increased SMN2 gene copy number (3 or 4 ), the average age of onset was ( 9. 9 ± 8. 5 ) months, 7 of 19 cases ( 36. 8% ) were type I , 10 cases ( 52. 6% ) were type I , 2 cases ( 10. 5% ) were type 口. The parents of 5 cases were performed SMN1 gene detection, heterozygous deletion were found in 9 parents, deletions of exon 7 and 8 were found in 8 parents. In the rest one case, the father was found to be a carrier of deletion of exon 7 and 8, however the mother was a non-carrier. Conclusions Gene SMN1 exon 7 and/or 8 homozygous deletion mutation was the direct cause of SMA. SMN2 copy number increase was negatively correlated with the severity of the SMA phenotype.【期刊名称】《中国循证儿科杂志》【年(卷),期】2013(008)003【总页数】4页(P216-219)【关键词】脊肌萎缩症；SMN1基因;SMN2基因;拷贝数变异【作 者】 王佶;安宇;周水珍;王艺;刘仁超【作者单位】 复旦大学附属儿科医院神经科,上海,201102;复旦大学生物医学研究 院出生缺陷研究中心,上海,200032;复旦大学附属儿科医院神经科,上海,201102;复 旦大学附属儿科医院神经科,上海,201102;复旦大学生物医学研究院出生缺陷研究 中心,上海,200032【正文语种】 中 文脊髓性肌萎缩症( SMA) 是常染色体隐性遗传性神经肌肉病，人群中发病率为1/6 000 ~ 1/10 000活产婴儿，最近报道中国人群SMA致病基因的携带者频率为 1/42 ［1］。

SMA居致死性常染色体隐性遗传病第2位，仅次于囊性纤维变性［2-4］位于染色体5q11.2 ~q13.3上的运动神经元存活(SMN)基因是 SMA的主要致病基因，具有两个高度同源的拷贝SMN1和SMN2，两者仅有5 个碱基的差别，分别位于第7、8 外显子和第6、7 内含子中既往研究已证实 SMN1基因突变可导致SMA发病，SMN2基因是临床表型的调节基因，拷贝数 增加可减轻SMA的表型［2,5］近年来中国对SMN2基因的研究较少［6 , 7］,缺乏表型与基因型的分析研究，同时SMA基因诊断国内多采用PCR-RFLP 分析技术，可判断SMN基因纯合缺失，但不能分析杂合缺失本研究纳入临床诊 断的SMA患儿，以多重连接探针扩增(MLPA)技术行SMN1基因缺失和SMN2 基因拷贝数检测，分析其与临床表型关系，以丰富中国人群SMA研究数据1 方法1.1 SMA诊断标准与分型神经专科医生根据发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断[8],检测到SMN1基因缺失可确诊根据1992年国际SMA协 作组制定的儿童型SMA的临床分类标准，分为3个亚型[8]:1型:6月龄内发病， 全身肌肉无力，肌张力减退，不能坐和站立，通常在2岁内死于呼吸衰竭；口 型:6 月龄后发病，能坐但不能独自行走，多数在进入青春期前死于呼吸系统并发 症；皿型:18月龄后发病，能坐和行走，预期寿命不减少，起病初可表现为走路不 稳和易跌倒等症状。

1.2研究对象复旦大学附属儿科医院(我院)临床诊断为SMA的患儿，纳入 SMN1基因第7和8夕卜显子检测到突变的确诊病例，同时检测患儿父母的SMN1 基因，分析杂合突变情况本研究SMA相关致病基因的检测均获得患儿家属的口 头知情同意1.3 MLPA拷贝数分析采集患儿外周静脉抗凝血3 mL,采用QIAgen公司试剂盒 (QIAamp DNA blood MiNi Kit 1250 , Cat No.51106)抽取 DNA 溶液 2 ~5 pg, -20°C保存参照 SMA MLPA 检测试剂盒(SALSA MLPA P060-B2 SMA probemix , MRC , 荷兰)的操作说明进行DNA变性、探针杂交、连接和荧光引物PCR扩增，应用 ABI 公司的3130自动化序列分析仪进行扩增片段分离、峰高和峰面积的检测检 测数据应用GENEMAKER 1.95软件分析处理根据试剂盒的说明推算SMN1和 SMN2基因第7和8夕卜显子的拷贝数:SMN1或SMN2的信号与内参信号的比值 为0.7 ~ 1.3，拷贝数为2，表示为正常；比值为0.35 -0.65，拷贝数为1,为杂 合缺失；比值为0表示没有拷贝，为纯合缺失；比值为1.3 ~ 1.5，拷贝数为3 ; 比值为1.5 - 2 ,拷贝数为4。

以拷贝数2为参照,多于2个拷贝数即为重复1.4统计学方法计量资料以表示，计数资料以百分比表示，率的显著性采用X2检 验,P < 0.05为差异有统计学意义采用SPSS 16.0软件进行统计分析2 结果2.1 SMN1基因拷贝数与临床表型关系41例临床诊断SMA患儿进行了基因检测， 37/41 例（ 90.2%） SMN1 基因第7和（或）第8外显子纯合缺失进入分析，其中 36例（97.3%）为第7和8夕卜显子均纯合缺失（图1A），1例仅第7外显子纯合缺 失男20例，女17例平均发病年龄（7.5 ±7.0）个月，3 d至6月龄19例，~ 18月龄14例，~3岁2例，＞3岁2例I型20例（54.1%） , 口型15例 （40.5%）,皿型2例（5.4%） ,I.H和皿型平均发病年龄分别为（2.9 ±1.8）、（10.7 ±1.9） 和（30.0 ±8.5） 个月2.2 SMN2基因拷贝数与临床表型关系37例SMN1基因第7和（或8夕卜显子纯 合缺失患儿中，SMN2基因第7和8外显子拷贝数2为18例（48.6%）,平均发 病年龄（4.9 ±3.9）个月，1型13例（72.2%） , 口型5例（27.8%）;第7和8外 显子重复（拷贝数3或4）为17例（45.9%）（图1B）,第7夕卜显子重复为2例（5.4%）,平均发病年龄（9.9 ± 8.5）个月，1型7例（36.8%） , 口型10例 （52.6%）,皿型2例（10.5%） , 口和皿型的比例显著高于拷贝数2的病例（P v 0.05） 。

图 1 SMA 患儿 SMN1 和 SMN2 基因 MLPA 检测结果 Fig 1 The results of SMN1 and SMN2 gene detection with MLPA method in SMA childrenNotes A: showing homozygous deletion peak of SMN1； B: showing homozygous deletion of SMN1，SMN2 copy number was greater than 3；C:S。