环磷酰胺免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体小鼠模型的建立.doc

1环磷酰胺免疫删减法制备细胞表面抗原 单克隆抗体小鼠模型的建立作者：郭紫芬 何淑雅, 朱炳阳, 廖端芳【摘要】 目的: 观察不同剂量环磷酰胺(CP)诱导免疫耐受的作用, 建立一个免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体（mAb）的动物免疫模型方法: 雌性 BALB/c小鼠经 CHO 细胞免疫后分别给予不同剂量的 CP 诱导免疫耐受, 选择血清抗体效价最低的一组小鼠按常规方式腹腔注射 CHOTM5 细胞进行免疫ELISA 测定各小鼠血清中 CHO 抗体及 CHOTM5 抗体效价, 检测血清抗体对 CHO 细胞与 CHOTM5 细胞结合反应的差异性结果: BALB/c 小鼠腹腔注射不同剂量的CP 后, 各剂量组均出现不同程度的免疫耐受作用CP 100 mg/kg 组与 CP 125 mg/kg 组小鼠血清抗体效价较低, 接近阴性对照组ELISA 检测显示 CP 100 mg/kg 组血清抗体与 CHOTM5 细胞呈阳性结合反应, 不与 CHO 细胞结合; 而CP 0 mg/kg 组血清抗体与 CHO 细胞与 CHOTM5 细胞的结合反应均呈阳性结论: CP 100 mg/kg 具有良好诱导小鼠对 CHO 和 CHOTM5 细胞的共同抗原表位产生免疫耐受, 相对增强对 CHOTM5 细胞目的抗原 hTM 的免疫应答的作用, 为免疫删减法制备细胞表面抗原 mAb 提供了一个理想的动物免疫模型。

【关键词】 免疫耐受; 环磷酰胺; 细胞表面抗原; ELISA环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)是一种非特异性免疫抑制剂, 可抑制各种动物的体液与细胞免疫应答［1, 2］, 与抗原联用时能选择性杀伤针对外来抗原迅速增殖 B 细胞, 并诱导机体在一定时期内对该抗原产生特异性免疫耐受, 而不影响机体免疫系统对其他抗原的识别国内外学者已将环磷酰胺免疫删减法成功用于单2克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的制备［3-5］ 但 CP 免疫删减作用效果难以控制, 给药剂量和给药时间是十分关键的因素因其不能完全抑制抗非目的抗原抗体的产生, 而药物本身的毒性作用往往可引起小鼠免疫系统的全面抑制, 使小鼠因感染等原因而死亡, 导致免疫的失败本研究拟针对细胞表面目的抗原提纯方法繁琐或提纯困难的特点, 进行了 CP 免疫删减法的动物模型研究, 为制备细胞表面抗原 mAb 的动物免疫模型选择提供参考依据1 材料和方法1.1 材料 环磷酰胺为上海第三制药厂产品; 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠 IgG 为法国 Immunotech 公司产品; BALB/c 小鼠购自中国科学院上海动物实验中心。

CHO 细胞株由南华大学药物药理研究所提供; 携带目的抗原 hTM 的CHOTM5 细胞株本人构建并保存于南华大学药物药理研究所M750B 紫外分光光度仪为江苏泰州无线电仪器厂产品; CO2 培养箱为日本 Sanyo 公司产品; COCI 型倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品; DG5301 型酶联免疫检测仪为国营华东电子管厂产品1.2 方法1.2.1 动物分组 将 8～10 周龄 BALB/c 雌性小鼠分为 8 组, 每组 3 只: ①CP 0 mg/kg 组; ②CP 25 mg/kg 组; ③CP 50 mg/kg 组; ④CP 75 mg/kg 组; ⑤CP 100 mg/kg 组; ⑥CP 125 mg/kg 组; ⑦CP 150 mg/kg 组; ⑧阴性对照组, 不用任何抗原刺激, 亦不应用 CP1.2.2 动物免疫 取生长良好的 CHO 细胞以无菌 PBS 洗涤 3 遍, 终以无菌 PBS悬浮, 调整细胞密度至 2×1010/L, 对 8 周龄的雌性 BALB/c 小鼠行腹腔注射3(1×107/只), 而后分别于 10 min、 24 h、 48 h 给小鼠腹腔注射不同剂量的免疫删减剂药物 CP。

2 周后重复此过程, 诱导小鼠对 CHO 和 CHOTM5 细胞的共同抗原表位产生免疫耐受第 2 次 CHO 细胞免疫后 10 d, 眼眶取血测定各小鼠血清中抗体效价, 选取抗体效价最低的一组小鼠与 CP 0 mg/kg 组, 经过 2 周后再按常规方式腹腔注射生长状态良好的携带目的抗原 hTM 的 CHOTM5 细胞免疫小鼠(5×106/只), 共免疫 3 次, 免疫间隔时间为 2 周1.2.3 ELISA 检测小鼠血清抗体效价及与细胞的反应性 第 2 次 CHO 细胞免疫后 10 d, 眼眶取血 ELISA 测定各小鼠血清中 CHO 抗体效价, 检测抗体对 CHO细胞的结合反应性在包被有 CHO 细胞的聚氯乙烯 ELSIA 板中加入不同滴度的血清, 37℃温育 2 h 后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 继续 37℃温育 2 h, 邻苯二胺显色液显色后在酶标仪上测定 490 nm 波长时的 A 值设阴性对照组小鼠血清为阴性对照, 2 g/L BSAPBS 为空白对照根据测定结果选取抗体效价最低的一组小鼠与 CP 0 mg/kg 组, 按常规方式用携带目的抗原 hTM 的 CHOTM5细胞免疫。

第 3 次 CHOTM5 细胞免疫后 3 d, 尾静脉取血, 方法同前进行ELISA 法测定小鼠血清中 CHOTM5 抗体效价, 同时检测抗体对 CHOTM5 及CHO 细胞的结合反应的差异性1.2.4 统计学分析 所有数据均用 x±s 表示, 用方差分析及两两 t 检验进行统计分析, 以 P0.05 为差异有统计学意义2 结果2.1 不同剂量环磷酰胺诱导小鼠对 CHO 细胞免疫耐受的影响 CP 0 mg/kg 组由4于没有免疫删减剂 CP 的抑制作用, 血清中抗 CHO 细胞抗体效价最高, 抗体滴度＞1∶10 000, 是我们此次实验研究用来评价 CP 免疫删减法增强小鼠对CHOTM5 细胞株的细胞表面目的抗原 hTM 的免疫应答效果的 CP 对照组除CP 150 mg/kg 组 3 只小鼠全部死亡外, 其余 CP 各剂量组小鼠血清与 CHO 细胞均有不同程度的结合反应, 与 CP 0 mg/kg 组比较(P0.05), 有统计学意义, 不同剂量的 CP 对小鼠有不同程度的免疫删减作用CP 100 mg/kg 组与 CP 125 mg/kg 组小鼠血清抗体效价较低, 均接近阴性对照组, 并且经过两两比较, 无统计学意义(图 1)。

因此, 为了避免 CP 剂量过大带来的毒副作用, 选择较小剂量组CP 100 mg/kg 组的小鼠准备后续 CHOTM5 细胞免疫2.2 环磷酰胺增强小鼠对 CHOTM5 细胞目的抗原 hTM 的免疫应答 CP 100 mg/kg 组血清中抗 CHOTM5 细胞抗体效价为 1∶2 000, 与 CHOTM5 细胞有较好的结合反应性, 与 0 mg/kg 组及阴性对照组比较, 有统计学意义(P0.05, 图2)ELISA 检测血清抗体（血清滴度为 1∶2 000）与 CHO 及 CHOTM5 细胞结合反应差异性的结果显示: 0 mg/kg 组血清与 CHO 细胞及 CHOTM5 细胞均能发生较好的结合反应, 而 CP 100 mg/kg 组血清只与 CHOTM5 细胞有较好的结合反应性, 而与 CHO 细胞不结合（图 3） 3 讨论环磷酰胺免疫删减法的基本原理［6］是当某种抗原诱发一种特异的免疫应答时, 相应的 B 细胞与 T 细胞克隆均发生增殖, 处于分裂期的细胞易被烷化剂 CP 选择性杀死, 因而当相同成分的抗原再次进入机体时, 机体对其免疫应答即被抑制, 并诱导机体在一定时期内对该抗原产生特异性免疫耐受, 而不影响机体免疫系统对其他抗原的识别。

因此环磷酰胺免疫删减法为 mAb 的制备提供一种新的途径5和可能, 即可用未经纯化的抗原进行免疫, 有利于获得预期的抗体, 减少了筛选的工作量等但值得注意的是, CP 的作用效果难以控制CP 的应用剂量、 程序对目的抗原分子的 mAb 的制备起着相当重要的作用因此 CP 免疫删减法用于 mAb 制备成功的关键是制造一个能良好区别两种相近组成成分的动物免疫模型本实验中设计了不同的 CP 剂量组诱导小鼠对 CHO 细胞产生免疫耐受CP 150 mg/kg 组由于剂量过大, CP 的毒副作用造成 3 只小鼠衰竭死亡; CP 25 mg/kg 组、 CP 50 mg/kg组以及 CP 75 mg/kg 组由于剂量过小, 不完全诱导小鼠特异性的免疫耐受; CP 100 mg/kg 组与 CP 125 mg/kg 组能较好降低机体免疫系统对 CHO 细胞的反应性, 有效完全诱导小鼠免疫耐受为了避免 CP 剂量过大带来的毒副作用, 我们选择较小剂量组(CP 100 mg/kg 组)进一步观察 CP 增强小鼠对目的抗原 hTM 免疫应答的作用ELISA 检测比较抗体与抗原的结合能力的差异时, 要求包被的抗原量相等。

本实验中 ELISA 检测小鼠血清 CHOTM5 抗体效价时尽管包被 ELISA 板的细胞数目一致, 但抗原蛋白量有很大的差异由于包被的目的抗原 hTM 含量远远低于CHO 细胞总蛋白量, CP 100 mg/kg 组对 CHOTM5 细胞的结合反应能力要弱于0 mg/kg 组(P0.05), 但 CP 100 mg/kg 组血清不与 CHO 细胞结合的事实说明CP 100 mg/kg 组血清抗体是特异性抗 hTM 的抗体总之, 我们成功地建立了一个免疫删减法制备细胞表面抗原 mAb 的动物免疫模型, CP 100 mg/kg 组能很好地诱导小鼠对 CHO 和 CHOTM5 细胞的共同抗原表位产生免疫耐受, 相对增强对 CHOTM5 细胞目的抗原 hTM 的免疫应答的作用, 为 mAb 的进一步研制打下了良好的基础6【参考文献】［1］ 姜玉章, 季晓辉, 李玉峰, 等. 环磷酰胺和环孢素 A 对 SLE 患者外周血 Th细胞亚群免疫调节的作用［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24(2): 172-174.［2］ Su YC, Rolph MS, Cooley MA, et al. Cyclophosphamide augments inflammation by reducing immunosuppression in a mouse model of allergic airway disease［J］. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117(3): 635-641. ［3］ Sleister HM, Rao AG. Subtractive immunization: A tool for the generation of discriminatory antibodies to proteins of similar sequence［J］. J Immunol. Methods, 2002, 261(1-2): 213-220.［4］ Sakakibara K, Sato K, Iwasaki T, et al. Generation of an antibody specific to Xenopus fertilized eggs by subtractive immunization［J］. Genes to Cells, 2005, 10(4): 345-356.［5］ Zijlstra A, Testa1 J E, Quigley J P. Targeting the proteome/epitome, implementation of subtractive immunization［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 303(3): 733-744.［6］ Williams CV, Stechmann CL,。