灵菌红素合成酶基因的克隆文献综述.doc

文献综述灵菌红素合成酶基因的克隆摘要：本文对灵菌红素的结构，生产该色素的相关菌种以及生理活性作了简要的概述，总结了灵菌 红素近年来的研究进展，尤其是关于PigC基因方面的研究，对灵菌红素的发展前景进行了展望 关键词：灵菌红素 菌种抑癌 抗菌 基因引言：灵菌红素(Prodigiosins)是可是一类含有3个毗咯环组成的甲氧基I此咯骨架结构的化合物，由沙 雷氏菌、放线菌及多种海洋细菌(包括Hahella chejuensis KCTC2396和假单胞菌)产生的一种天然 色索⑴Microbiology,Dcc2006朋7^99.,其中以Serratia属微生物生物合成灵菌红素的报道居多由 于具有抗细菌、抗疟疾、抗真菌、抗原生动物、抗癌⑵、免疫抑制活性4】和快速杀死导致赤潮 的大部分浮游生物2】等重要生物活性，因此它在医药、食品添加剂、环境治理、纺织染料Ml和农 业病虫害防治［门等方面具有广阔的应用前景和巨大的研发价值用化学合成法大量制备PG 一直未 能实施，人们寄希望于微生物发酵生产目前国内外对产PG微生物的研究主要集中在陆地微生物 沙雷氏菌上现对灵菌红素的结构、生物活性、研究现状及发展趋势作一综述。

1.灵菌红素的理化性质灵菌红素(Prodigiosins)是一类含有3个毗咯环纟H•成的甲氧基毗咯骨架结构的化合物灵菌红素 (prodigiosins)又名灵菌素、灵杆菌素，分了式为C20H2N305 (M=323.1968),具有三毗咯环骨架结构， 根据其侧链基链基团结构的不同，灵菌红素族还包括除Prodigiosin外的Prodigiosin- 25-C, metacycloProdigiosin Prodigiosen Cycleprodigiosin, desmethoxyprodigiosin 和 Uncedylprodigiosin 等-* 系列结构和性质相似的物质灵菌红素是一种呈暗红色的色素，具有绿色反光，熔点151.152Co 在碱性或中性溶液中呈橙黄色，酸性溶液中呈红色在中醉溶液中，酸性条件下在540 nm处有特征吸 收，碱性条件下在466 nm处有特征吸收，PG属于脂溶性色素，易溶于甲醇，丙酗，氯仿和苯，不 溶丁•水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醸或石油醍中微溶或 不溶，PG对温度稳定，但受pH的影响较大，酸性环境小能保持较长的时间，碱性条件下则损失较 大；A产，Ca2+, K+, B芒等金属离子对PG的稳定性煤响不大，有使PG增色的作用，Mg”和 一对PG有一定的破坏作用，Pb?+可以络合PG,使之成为沉淀，白光和蓝光使PG发生光解，在 红光和远红光下PG则不会降解叫2.生产灵菌红素的菌种陈月琴从大亚湾表面海水中分离到的1株海洋产灵菌红素细菌，通过对该菌株16S rRNA基因 的测定与分析，并与Genbank的数据进行比较，认为该菌属于假单胞菌属。

刘军⑭对威海近海海水和海泥中的产色素细菌进行筛选分离出1株高产红色素的细菌S15,利 用16S r DNA对S15菌株基因组DNA进行扩增，测序得到其部分16S r DNA序列，经Blast调出与 菌株I6S rDNA同源的序列，用软件MEGA (4.0)按照Neighbor・Joining方法构建16S rDNA系统 发冇树，判断该菌为沙雷氏菌属的一个种提取色索后，对该红色索理化性质的试验发现，其光、热 等稳定性强，而H2O2. Ca2\ F尹对其稳定性影响显著张琴"研究的是变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)的rel A突变株，它们能合成微最放线紫红 素和十一-烷基灵菌红素Scrtan-dc Guzman 121从菲律宾的被囊类动物中分离出一种新的贋弧杆菌Z143-1,它能酵解葡萄 糖产生红色素(16甲基・15庚基■灵菌红素)，该色素对金黄色葡萄球菌有抑菌作用D. Kim 筛选出一株海洋菌株Hahella chejuensis KCTC 2396,它产生四种不同比例的灵菌红素, 均具有生物活性3灵菌红素的生物活性3.1抗肿瘤作用PG具有有效的抗肿瘤活性，美国国立癌症研究所(NSI)Melvin等发现PG在平均IC50为 2.1中nol・L・l时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌 在内的八种癌细胞株中的57种不同的人癌细胞均有抗性作用。

3.1.1灵菌红素对人胰腺癌细胞增殖有抑制作用〔⑷有人通过用生物工稈技术得到灵菌红索，通过MTT法研究了其对人胰腺癌细胞8898的增殖抑 制作用和部分作用机理，实验结果显示，加入灵菌红素示的细胞表现出了凋亡细胞特异性，灵菌红 素对于恶性肿瘤细胞，在较低的浓度下(24h培养，IC50值约为20〜25遽ml J即显示出了相当的杀 伤效果，灵菌红素对肿瘤细胞形态学有一定的作用实验提示其可能具有诱导肿瘤细胞凋亡的作川 及具有靶向性抗肿瘤细胞增殖的作用因此灵菌红素作为一种极具特色的抗癌新药，在这方面具有很 大的潜力3.1.2灵菌红素对白血病，癌细胞作用研究有人对于海洋羽毛山海绵Mycaleplumose的放线菌糖多孑包菌Saccharopolyspora sp. (SP2. 10)产生 的计•一烷基灵菌红素I■一烷基灵菌红素Metacycloprodigiosin (MP)抗肿瘤活性及其作用机制进彳亍了 研究先采用MTT法观察测定了MP对小鼠白血病细胞株P388、人肝癌细胞株BEL. 7402细胞生长的 影响；采用流式细胞术，检测了MP对P388、BEL细胞周期变化的影响；采用Western Blot?4检测PARP 的裂解情况，判断MP诱导两个细胞系?周亡活性。

研究结果表明，MP能明显抑制P388. BEL 7402肿 瘤细胞生长,将细胞阻断于G2 / M期并诱导凋亡；MP诱导活性氧是其导致细胞生长抑制的重要机制, 并与其诱导的P38、JNK活化密切相关，而与ERKI / 2活化无关；并且初步发现MP还能够抑制肿瘤转 移的多个环节，可能对肿瘤转移具有抑制作用3.1.3灵菌红素对乳腺癌细胞的作用I⑹Ho, Tsing-Fen Peng, Yu-Ta等研究发现灵菌红素是一种强有力的抗癌活性细菌的代谢产物，这是 rfl于它的凋亡作用选择性地在恶性细胞活跃灵菌红素可剂量依赖性诱导下，可调节包括乳腺癌生 存素在内的多种乳腺癌细胞系MCF-7, T-47D和MDA-MB-231 o3.2免疫抑制剂活性口链霉菌属和沙雷氏菌生产出红色物质包括灵菌红素metacycloprodigiocin , prodigiosene, methoxyprodigiosin和灵菌红素25 - C具有抗疟疾的抗菌活性，尤其是灵菌红素25・C显示了抑制免 疫的作用灵菌红素对T淋巴细胞的免疫反M有抑制效果，灵菌红素在其有效浓度范围没有显示毒性 因此，灵菌红素可以用来作为免疫抑制或在各个领域的标准物质，包括免疫疾病的治疗需要，器官 或组织移植和免疫细胞为基础的疾病研究3.3灵菌红素抗菌作用研究发现MS-02-063菌株能产生大量的灵菌红索类似物PG-L-1,通过NCCLS法研究其体外抗 真菌活性〔罔，研究结果表明，尽管其最小抑制浓度值比联苯节II坐微微要高，但却显示出了抗医学上 分离的9种Trichophyton的菌株的能力，尽管PG-L-1导入角质层表皮的效率比联苯节哇要低，但在 低浓度下却显示出了更大的抗真菌潜力。

3.4灵菌红素抗疟疾活性Isaka等从Streptomyces spectabilis BCC 4785的发酵产物中分离得到的MP有显著的抗疟疾活性 体外实验表明，其抑制 Plasmodium falciparum K1 的 IC50 为 0.00500.001 0pg/mL[ 19201此外灵菌红索的应用非常广泛，例如Nobutaka Somcya等㈤研究了植物附生微生物产灵菌红索 在生物控制过程中的作用的稳定性，实验分析了抗药灵菌红素的16sRNA与假单胞菌，根瘤菌等同 属实验结果显示，I古I有附生植物微生物可能可以通过削弱药物抗生素的能力从而妨碍植物病原体 与生物控制药物的相互作用Tsukiiba等Bl从沙雷氏菌中提取疾病抑制基因导入启动子控制的稻米 细胞，发现这些基因修饰过的微工物能不受生物及非生物因素影响而有效抑制由Pyricularia oryzae 引起的稻米爆发性疾病；也可作为一种新型的饲料添加剂，纺织工业中的染料，具有稳定性好，安 全性高，抑菌能力强，生产方便等优点，目前正在开发应用当中〔却4灵菌红素生产现状和发展趋势Wei等㈣2习以改进的LB培养基(MLB,提高胰蛋白豚和酵母膏的浓度并去除了 NaCI)发酵 沙雷菌生产PG,约比LB增产3倍，达152mg/L；在培养基中添加2%〜6%的植物油，如豆油、 棕柵油、葵花子油等可促进PG的合成，最高达790 mg/L,表明PG合成与胞外生物表面活性剂的 存在有关。

在YE培养基中添加含毗咯环的脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸可显著促进UP的合成当 添加10g/L的脯氨酸时，产量可达2.5g/L0Cang等〔旳从土壤中分离获得一株沙雷菌S389,以乙醇为唯一碳源,PG产量最高可达2.95 g/LGiri等I"〕在黏质沙雷菌的培养基中分别添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉，均能显著增加PG产 量，其中以添加花生籽粉最为显著，达到38.75 g/Lo20世纪80年代以来，人们开始从基因水平研究PG的生物合成途径及其调节，1983年Feitelson 等［绚克隆了夭蓝色链霉菌与PG合成相关的基因簇，Thomason等国则首次将分离得到的Serratia PG 生物合成基因转入欧文氏菌(Erwinia carotovora)质粒，成功表达并得到了 PG1 ■二拜毗咯・5■竣酸还原酶催化合成脯氨酸的报后一步，该酶由proC基因编码对链霉菌来说， 脯氨酸是合成灵菌红素的前驱物质c Barona-Gomez等卩】研究发现多拷贝proC基因可使链霉菌A3(2) 产生灵菌红索，但是删除该基因却不会引起脯氨酸缺陷型的突变strcptorubin B (cyclic)和十•一烷基 灵菌红素的合成在动力学上有着一定地联系。

Jeffery T. Davis⑶】研究发现灵菌红素具有可作为单质了配体与阴离了结合，包括C1 ■和HCO3-o 它可以穿过磷脂双分了层，具有很强跨膜阴离了载体功能，可成为HCI的协同转运体随着生物操作技术的发展和对PG的深入研究，人们将更加清晰地认识PG的产生和作用机制, 大量生产制备PG,用于替代在癌症及免疫治疗中对人体有害作用的化学药物，造福于人类参考文献：[1 ] Neil R・ Williams on, Peter C・ Finian J, Leeper P.C.Salm ond. The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines[J].Nature Review.[2 ] Williamson N R, Fineran P C, Grist wood T, c.g ・ Anticanccr and immunosuppressive properties of bacterial p rodiginines[J]. FutiireMicrobiol, 2007, 2 (6): 605-618 .[3 ] Pandey R, Chander R, Sainis K B. Prodigiosins: a novelfamily of immunosupp ressants with ticancer activity [J]. Indian J Biochem Biophys, 2007, 44 (5): 295-302 .[。