人类免疫缺陷病毒I型HIV-RNA核酸定量检测SOP.doc

人类免疫缺陷病毒〔I型〕核酸定量检测系统标准操作程序1. 目的：规超敏PCR仪器配置系统及人类免疫缺陷病毒〔HIV-I RNA〕的检测过程，确保检测结果的准确性和重复性2. 检测方法和原理2.1 检测方法：TaqMan探针荧光定量PCR法2.2 检测原理：人类免疫缺陷病毒〔I型〕核算定量检测试剂盒〔PCR-荧光法〕采用核酸扩增技术，定量检测人血浆中HIV-I RNA该方法包括三个主要步骤：〔1〕样品制备以别离HIV-I RNA；〔2〕靶RNA的逆转录形成互补DNA〔cDNA〕；〔3〕靶〔cDNA〕的PCR扩增以及裂解的、靶特异性的、双标记寡核苷酸探针的检测3. 标本要求3.1 标本类型：血浆〔EDTA抗凝〕3.2 标本的采集与处理3.2.1 标本采集量：采集患者静脉血6 mL〔EDTA抗凝真空采血管〕3.2.2 标本处理：标本采集后应在2小时送至实验室，实验室收到标本后在1小时处理标本3.2.2.1签收：门诊、住院以及CDC标本签收条码，并做好相关登记工作 3.2.2.2：对标本进展唯一，容如下："年月日6位数字+标本号3位数字〞，例如2018年1月1日收到一个HIV-RNA标本即为："180101401〞。

3.2.2.3离心：800-1600g,20min离心标本3.2.2.4标本保存：血浆在室温〔25-30℃〕最多存储1天；2-8℃最多存储6天；-20℃—-80℃可存储6周将待检血浆以2管每管1200 uL量存储于2.0mL戴螺旋盖的无菌聚丙烯管，在管壁编写如3.2.2.2的未检标本放置于专用样本盒中，冻存于-80 ℃冰箱已检血浆置-80ºC冰箱保存2个月，到期后按科室有关程序作废弃标本处理4.仪器和试剂4.2 试剂：〔配套封闭试剂〕4.2.1 试剂盒〔包含核酸提取试剂、质控品及阳性定量参考品组分、PCR 检测试剂组分〕保存于2-8℃环境下，有效期22个月4.2.3试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不应超过72小时；2-8℃条件下不超过30天4.2.4 主要组成成份：组份名称规格数量质控品阴性质控品1000μL/管1临界阳性质控品1000μL/管1强阳性质控品1000μL/管1HIV2CS148测试1HIV2CS248测试1HIV2CS348测试1HIV2CS448测试15.标准操作5.1 COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 的配置如下：配置实验所需的架子和耗材相应位置COBAS AmpliPrep_COBASTaqMan 48a. K-tubes放在样本架上b. 带有K-tips 的K-tip 架c 将带有样本或质控的S-tubes 放在样本架上d. 带有SPUs 的SPU-架e. CS1放在一个试剂架f. CS2, CS3, CS4放在一个试剂架g. 将空的K-carrier 放在 K-carrier 架上样本核酸提取完成后：K-carrier上的K-tubes 手工转移 F-HM-PF-HJ-LAB-EM-P(M-P)6.2. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用试剂及耗材的保存及考前须知：1). 所有试剂〔HIV-I test试剂〕2-8℃保存，即拿即用；2). 试剂启用后，可保存28 days (2-8℃)；3). 试剂启用后，在Cobas Ampliprep上累计使用时间最多64 hrs；4). CTM(-)阴性质控、L(+)弱阳性质控、 H(+)强阳性质控，使用后的废弃；5). 洗液2-30℃保存，翻开后可使用28 days；6). 耗材〔S-tube/样本条码/K-tip/K-tube/SPU〕常温保存。

6.3. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用样本的保存及考前须知：1). 需要的样本为血浆；2). 血样在2～25 ℃下运输，24hrs (HIV RNA)收集出血浆(室温800-1600g离心 20分钟)；3). HIV RNA检测：血浆可在室温下(25-30℃)保存最多1天，在2～8℃最多保存6天，或者-20~-80℃下长期保存，至少6周；4). 血浆建议倒取1100-1200 μL进展保存；5). 血浆冷冻时，最多冻融5次不损失HIV RNA6.4. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 HBV DNA定量检测操作流程：A仪器初始化及维护A1 翻开COBAS AmpliPrep 和 COBAS TaqMan 开关，等待仪器初始化完成，为 stand-by 状态A2登陆电脑及 AMPLILINK 软件登陆Windows® *P操作系统〔 User ID 和 password〕a) 双击桌面上AMPLILINK 软件图标b) 登陆AMPLILINK 软件〔 User ID 和 password〕A3通过软件Status界面检查洗液量是否足够，如不够需要更换新的洗液A4检查软件维护界面Due 按钮以下出的需要进展的维护容，按照维护手册进展相应容的维护工作 ，COBAS AmpliPrep 仪器自动进展系统初始化工作B加载试剂将所有试验需要的试剂匣从 2-8°C 冰箱拿出，立即放在试剂架上并放入 COBAS AmpliPrep 仪器中，试验开场前在仪器上平衡至少30分钟。

不要将试剂匣放在仪器外进展温度平衡，以免在试剂匣外表形成水凝结，造成条码的损坏如果在试剂匣外表有水凝结，不要对条码部位进展擦拭，以免损坏条码造成仪器无法对条码进展辨识B1将CS1 试剂匣放在一个试剂架上，将试剂匣 CS2, CS3 和CS4 放于另一个试剂架上B2将放有CS1的试剂架放入到COBAS AmpliPrep 仪器中的A位置B3将放有CS2, CS3 和 CS4的试剂架放入到COBAS AmpliPrep仪器中的B、C、D、E的任一位置C加载耗材 注意：根据检测的样本数计算需要的COBAS AmpliPrep 试剂匣数目, 样本处理单元(SPU), 样本管(S-tube), K-枪头(K-tips) 和 K-管(K-tubes) 的数量 每个样本或质控分别需要 一个SPU, 一个S-tube, 一个K-tip 和一个K-tube C1加载样本处理单元 (SPUs)计算需要SPU数量，一个样本或质控需要一个SPU 将SPUs 放入到SPU 架中，向下压SPU的边缘局部〔不要碰到S-tip的局部〕使SPU完全坐稳在SPU架的底部确认 SPUs 正确的放入在SPU 架中 (假设SPUs放置不正确，可能造成仪器运行中停顿)将SPU 架放入到COBAS AmpliPrep仪器的 J, K 或 L位置C3使用COBAS TaqMan 48 分析仪时，将K-carriers 放在K-carrier 架上，放在COBAS AmpliPrep 的M, N, O 或 P 位置C4加载K-tip 架于COBAS AmpliPrep 上M, N, O 或 P 位置D创立命令和加载样本D1样本架准备，将样本的条码夹放在样本架上相应有样本管 (S-tube)的地方 将专用于质控的条码夹放在样本架上与阴性质控(-) C, 弱阳性质控L(+) 和强阳性质控相对应的地方注意对相应的质控使用正确的质控条码夹D2& D3通过AMPLILINK 软件创立命令〔见以下图〕在软件orders界面下的Sample rack 按钮下创立样本及质控的命令选择相应的检测工程，并进展保存打印创立好的样本及质控工作表D4&D5在生物平安柜中进展样本准备涡旋混匀样本及质控3-5秒，将1000 µl 样本及质控品转移到相应的样本管S-tube中；防止将颗粒或凝块状物质转移到样本管S-tube中装有样本及质控的样本管放到样本架相应的位置〔与创立好的命令工作表中的位置一致〕；确保质控条码上的lot 与质控的lot 一致；确保相应的质控使用正确的质控条码夹 ；防止样本或质控污染样本管S-tube的上部D6加载带有样本管的样本架于COBAS AmpliPrep 仪器的F, G 或 H 位置E开场运行COBAS AmpliPrep 仪器E1在AMPLILINK 软件上启动运行COBAS AmpliPrep检查Status 界面下，确保没有样本、质控或试剂被锁住 确保所有的样本和耗材都已加载到COBAS AmpliPrep中，点击Start 按钮FCOBAS AmpliPrep 仪器运行完毕后，手工转移提取好的样本到COBAS TaqMan48中，应防止将所有提取好的样本及质控直接放置于日光或光源下 F1检查AMPLILINK 软件中可能显示的标记flags及错误信息F2在COBAS AmpliPrep处理好的样本及质控必须在120 分钟转移到COBAS TaqMan 48 中开场反响，不要冷冻或在2-8°C储存处理好的样本及质控 。

F3丢弃COBAS AmpliPrep 仪器中的废物G加载处理好的样本及质控G1加载处理好的样本及质控到COBAS TaqMan 48 中– 通过K-carrier 转移工具，手工转移带有 K-carrier 的 K-carrier 架到COBAS TaqMan 48 中H开场运行COBAS TaqMan H1翻开扩增仪的外部盖子，将 K-carrier 放入到扩增模块中并关闭盖子，开场运行COBAS TaqMan 48ICOBAS TaqMan 48 运行完毕I1运行完毕，打印结果报告 检查结果中的标记flags 或错误信息承受结果，数据自动备份(archive)I2将检测完毕的K-tubes 从COBAS TaqMan 48的废物盒中拿出，根据实验室规定进展相应处理或丢弃 7.质量控制7.1 阴性质控品：必须产生"没有检测到目标〞的结果如果有标记标为无效，则整个批次都是无效的7.2 阳性质控品：阳性质控品的检测值应该落在其指定的围，如果一个或两个质控品标记表示无效，则整个批次无效8.结果报告对于有效批次，检查每个样品是否在结果打印中出现标记或注释结果解释如下：有效批次可能包括有效和无效样品的结果，这取决于每个样品是否得到标记和/或注释。

样品结果解释如下：测定结果解释没有检测到目标HIV-I的CT值超出该检测的界限之上或者未能获得HIV-I的CT值报告为"HIV-I RNA not detected〞<2.00E+01cp/mL计算所得的cp /mL结果低于该检测试剂检测限报告为"<20 cp /mL〞≥2.00E+01 cp/mL且≤1.00E+07 cp/mL该区间为检测系统的线性围>1.00E+07cp /mL结果超出线性围报告">1.00E+07 cp/mL〞如果希望得到定量结果，必须稀释原始样本，重复该测试以1：100与HIV-I阴性经EDTA处理人类血浆稀释根据稀释因子换算最终的结果9.性能参数9.1 最低检出限及定量限：试剂最低检出限浓度为20 cp/mL9.2 精细度：检测高浓度〔1.00E+07 cp/mL〕，低浓度〔2.00E+01 cp/mL〕HIV样本，批及批间的检测浓。