微生物来源的抗生素JXJ-301-1的研究.doc

1微生物来源的抗生素 JXJ-301-1 的研究作者：张炳火 李汉全 张玉琴 过七根 杨建元 文孟良【摘要】 从一株未鉴定的微生物菌株的次级代谢产物中分离到一个化合物 JXJ-301-1，通过对该化合物在氘代氯仿和氘代二甲亚砜两种溶剂中的核磁共振数据分析，结合质谱、红外光谱和元素分析，证明该化合物是鬼臼毒素本研究扩展了鬼臼毒素的来源 【关键词】 微生物； 鬼臼毒素； 核磁共振ABSTRACT A compound JXJ-301-1 was isolated from the fermentation broth of an uncharacterized microbial strain. Based on NMR, MS, IR and elemental analysis, its chemical structure was elucidated as podophyllotoxin originally produced by plants. This study extended source of podophyllotoxin and provided new way to produce podophyllotoxin by fermentation of microorganisms.KEY WORDS Microorganism; Podophyllotoxin; Nuclear magnetic resonance (NMR)鬼臼毒素是一种具有抗肿瘤活性的木脂素类天然产物，主要来源于鬼臼类植物，可作为半合成抗肿瘤药物 etoposide，teniposide 和 etopophose 等的前体物质［1］。

由于鬼臼毒素天然来源缺乏，而合成又未达到商业化的要求［2］，因此限制了对该类药物的进一步开发目前虽有研究表明鬼臼类植物的内生真菌可以产生鬼臼毒素［3］，但是鲜有从微生物代谢产物中分离纯化出鬼臼毒素的报道在对一株未鉴定的微生物次级代谢产物研究的过程中，分离到了一个化合物 JXJ-301-1，经鉴定为鬼臼毒素(化学结构式见 Fig.1)本文主要报道该菌株的发酵、化合物 JXJ-301-1的分离纯化、以及结构解析等工作1 仪器与材料21.1 菌株和培养基菌株 JXJ-301 菌株分离自中国江西庐山土样，未鉴定种种子培养基 酵母膏 4g，葡萄糖 4g，麦芽膏 10g，复合维生素 3.5mg，微量盐1ml，定容至 1000ml，pH7.2(微量盐组成： FeSO4·7H2O 0.2g，MnCl2·4H2O0.1g， ZnSO4·7H2O 0.1g， 双蒸水 100ml)发酵培养基 大豆粉 20g， 葡萄糖 20g， 酵母 Fig.1 Structure of podophyllotoxin膏 2g， 淀粉 5g， 蛋白胨 2g，NaCl 4g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 2g，定容至 1000ml，pH7.8(定容测 pH 后，再将 CaCO3 在加入培养基内)。

1.2 仪器和其它材料质谱用 VG Auto Spec-3000 型质谱仪测定；核磁共振用 Bruker AVDRX500 测定； 红外用 AVATAR360F-IR 测定；元素分析用德国 Vario EL 有机元素分析仪测定；柱层析用凝胶 Sephadex LH-20(安玛西亚生物技术有限公司)；Amberlite XAD-16大孔吸附树脂(中科安泰)；柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂生产；所用试剂均为重蒸工业试剂2 方法与结果2.1 发酵方法将生长良好的斜面接种于种子培养基，28℃、200r/min 摇床培养 48h，再接种于发酵培养基，接种量为 1∶10，置于 28℃、200r/min，摇床培养 5d32.2 代谢产物分离纯化方法发酵液 3000r/min 离心 20min，得到的上清液用 Amberlite XAD-16 大孔吸附树脂吸附，萃取相用甲醇∶丙酮(1∶1)有机溶剂洗脱，洗脱液减压浓缩，并用柱层析硅胶(200～300 目)拌样，干法上硅胶柱，以氯仿∶甲醇(V∶V)=20∶1→16∶1→14∶1→12∶1→9∶1→7∶1→5∶1→0∶1 梯度洗脱，将所得目的组分上凝胶柱 Sephadex LH-20，甲醇为展开剂。

凝胶柱上洗脱下的目的组分以湿法上硅胶柱，洗脱液为氯仿∶乙酸乙酯(V∶V，3∶1)，最后将硅胶柱上洗脱下的目的组分上凝胶柱Sephadex LH-20，甲醇为展开剂，即得化合物 JXJ-301-1 纯品整个过程采用硅胶薄层层析和茴香醛显色剂显色检测跟踪 2.3 化合物 JXJ-301-1 的理化性质和光谱数据化合物 JXJ-301-1 是无色针晶(氯仿和石油醚)，在薄层层析硅胶板上 UV365nm下无荧光，UV254nm 下有很强暗斑，茴香醛显色剂显棕灰色质谱 ESI(+)-MS(m/z)：437［M+Na］+，851［2M+Na］+，397［M-OH］+，415［M+H］+元素分析结果：C 为 63.44%，H 为 5.59%，O 为 30.97%质谱和元素分析表明该化合物分子式为 C22H22O8，有 12 个不饱和度IR(KBr)cm-1 表明存在 3446 处的羟基吸收带(OH),1771 处的羰基吸收带(C=O)，1589 和 1490 的苯环特征吸收带，以及 1234，1124，1040(C-O-C)和 931(OCH2O)等基团的特征吸收1H-NMR(溶剂 CDCl3)：2.74～2.77(2H，m，H-8，H-8′)，3.69(6H,s,10-OCH3，12-OCH3)，3.73(3H，s，11-OCH3)，4.01(1H，t，J=9.7，H-9′)， 4.53(1H，m，H-9′)，4.50(1H，d，J=9.0，H-7)，4.63(1H，d，J=9.0，H-7′)， 5.88(1H，d，J=1.5，H-10′)，5.90(1H，d，J=1.5，H-10′)，6.33(2H，s，H-2，H-6)，46.42(1H，s，H-5′)，7.09(1H，s，H-2′)。

13C-NMR(溶剂 DMSO-d6)和 13C-NMR(溶剂 CDCl3)的光谱数据见 Tab.1在13C-NMR(溶剂 DMSO-d6)中，可见 18 个 13C 信号，与分子式中碳原子相比少 4个 13C 信号，说明 JXJ-301-1 结构中存在对称因素，应有四对重叠的信号经过对 1H-NMR、1H-1H COSY、DEPT 谱、HMBC 和 HSQC 的研究表明，在以DMSO-d6 为溶剂的 13C-NMR 中，化学位移在 56.8 处的 C-10 和 C-12 氧甲基信号重叠；化学位移在 109.4 处的 C-2 和 C-6 次甲基信号重叠；化学位移在 137.4 处的 C-1 和 C-4 季碳信号重叠；化学位移在 152.9 处的 C-3 和 C-5 季碳信号重叠在以 CDCl3 为溶剂的 13C-NMR 中，可见化学位移在 55.2 处的 C-10 和 C-12 重叠信号；化学位移在 107.5 处的 C-2 和 C-6 重叠信号；化学位移在 151.5 处的 C-3 和C-5 季碳信号重叠；而化学位移在 134.9 的 C-1 季碳信号和 136.1 的 C-4 季碳信号 得到分离。

经过与文献［4］中 13C-NMR 光谱数据的详细对照(Tab.1)，最终确定化合物 JXJ-301-1 为鬼臼毒素3 结论鬼臼毒素是一种主要来源于鬼臼类植物，具有抗肿瘤活性的木脂素类天然产物由于目前未有微生物来源的鬼臼毒素分离纯化和结构解析的报道，因此在我们获得化合物 JXJ-301-1 后，结合质谱、红外光谱和元素分析和分别以 DMSO-d6 和CDCl3 为溶剂进行了 1H-NMR、13C-NMR、HSQC、1H-1H COSY 和 HMBC 谱的测定和光谱学研究，并与文献［4～6］对比分析，证明该化合物是鬼臼毒素该研究扩展了鬼臼毒素的来源，为利用微生物发酵获得该植物来源的抗肿瘤天然产物打下了基础5【参考文献】［1］ Farkya S, Bisaria V S, Srivastava A K. Biotechnological aspects of the production of the anticancer drug podophyllotoxin ［J］. Appl Microbiol Biotechnol,2004,65(5):504～519［2］ Petersen A, Alfermann W. The production of cytotoxic lignans by plant cell cultures ［J］. Appl Microbiol Biotechnol,2001,55(2):135～142［3］ 杨显志，郭仕平，张玲琪. 鬼臼类植物产鬼臼毒素内生真菌的筛选［J］. 天然产物研究与开发，2003，15(5)：419～422［4］ Miyata M, Itoh K, Tachibana S. Extractives of Juniperus chinensis L. I: Isolation of podophyllotoxin and yatein from the leaves of J.chinensis ［J］. J Wood Sci 1998,44:397～400［5］ 时岩鹏，韦兴光，姚庆强. 六角莲化学成分的研究［J］. 中草药，2005，36(4)：484～486［6］ 廖矛川，王有为，屠治本，等. 西藏八角莲的化学成分研究［J］. 武汉植物学研究，2002，20(1):71～74。