发酵工艺原理4.ppt

第三章 灭菌(sterilization) n灭菌的原理及方法 n培养基和发酵设备的灭菌工艺 n 空气除菌 n灭菌：指用化学或物理的方法杀灭 或去除物料及设备中所有生命物质 的技术或工艺过程 第一节 灭菌的原理及方法n一 几种常见的灭菌方法 1 化学物质灭菌 原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使 蛋白质变 性酶失活 常用的灭菌剂: 使用范围： 器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌， 不能用于培养基灭菌 常用的灭菌剂化学物质名称有效浓度化学物质名称有效浓度新洁尔灭(苯扎溴铵)0.25%甲醛37%杜灭芬0.25%戊二醛2%高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%过氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（来苏尔）1%—5%*2. 辐射灭菌n原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸 的光化学反应造成菌体死亡n常用：紫外线、X射线和γ射线n使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌 3．干热灭菌 n原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变 性和电解质浓缩作用而杀灭微生物n常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时n 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌4．湿热灭菌 n原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力 ，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。

n常用方法： 水煮常压灭菌：100℃ 饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟n使用范围：培养基和发酵设备灭菌 5．过滤除菌 n原理：利用微生物不能透过滤膜除菌n方法: 0.01~0.45 m孔径滤膜， n使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他 不耐热化合物溶液除菌 二. 湿热灭菌原理 n1.生物热死动力学（对数残存定律）dN / dt =- K N N：菌体个数（个） t : 灭菌时间（min） k：反应速度常数（min-1） dN / dt: 菌受热死亡速率(个/min) Ln N/ N0 = - K t N= N0 e- K t 以菌的残留数Ln N/ N0的对数与时间t 作 图，得出一条直线，其斜率为- K （ P222 图14-1）如何通过实验根据对数残存定律确定某一 温度,某一微生物的K ？1). K 与菌种的特性有关相同温度下，微生物越耐热， k值越小 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大2 .反应速率常数K2). K 与灭菌温度有关K=A e –E / RT （阿累尼乌斯方程） Ln K =Ln A- E/ RTA：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) △E：杀死细菌所需的活 化能（J/ mol）121℃118℃115℃ 110℃105℃第二节 培养基和发酵设备的灭菌工艺 n一．培养基灭菌时间的选择t =1/ k * Ln( N0/ N) 其中 K：一般耐热的细菌芽孢的K值N0 ：细菌及芽孢数之和N：10 -3二. 培养基灭菌温度的选择选择即能达到灭菌要求， 又保证营养成分不被破坏的温度n1.培养基营养成分破坏动力学方程 -dC/dt = K’ C -dC/dt :营养物降解速度 mol / L h C: 营养物浓度 mol / L K’ : 营养物降解反应速度常数 1 / s t ：时间( S ) Ln (C/ C0 ) = - K ' tK’ = A’ e- E’/ RT Ln K’ =Ln A’- E’/ RT A’：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E’：营养物破坏所需的活化能（J/ mol）2.根据实验结果灭菌活化能大于培养基破 坏活化能 E＞ E’ P225 表14-11 3. 灭菌反应营养物破坏反应 T1 Ln K1 =Ln A- E/ RT1 Ln K1’ =Ln A’- E’/ RT1 T2 Ln K2 =Ln A- E/ RT2 Ln K2’ =Ln A’- E’/ RT2Ln ( K2/ K1) = E/ R(1/ T1- 1/ T2 ) Ln ( K2’ / K1’ )= E’/ R(1/T1- 1/T2) Ln( K2/ K1) = E Ln ( K2’ / K1’ ) E’ Ln ( K2 / K1) ＞ Ln ( K2’ / K1’ ) K2 / K1 ＞ K2’ / K1’ 当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速 度常数变化得大4．达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t 越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好n 三 影响灭菌效果的因素n微生物种类：不同的微生物k值不同。

n初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与 初始菌量N0的对数成正比n培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐 热性 n传热与混合状况：影响受热均匀度 n培养基中固体颗粒的存在影响热穿透 n蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度 npH：酸性pH下可加快微生物热死速率 四. 培养基和发酵设备的灭菌方法 （一）实验室种子培养基灭菌方法使用高压蒸汽灭菌锅 手提式灭菌锅立式或卧式灭菌锅容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)四. 培养基和发酵设备的灭菌方法n（二）分批灭菌(batch sterilization) n1．定义：将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽 加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭 菌方式n 2．操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测 升温：把培养基加热到灭菌所需的温度 保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间 冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度 温度随灭菌时间的变化三路进汽：直接蒸汽 从通风、取样和出料 口进入罐内直接加热 ，直到所规定的温度 ，并维持一定的时间 这就是所谓的“三 路进气”四路出汽：直接蒸汽 从排气、接种、进料 和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图n 三）连续灭菌(continuous sterilization)1．定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连 续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌 方式。

2．流程：1)由热交换器组成的灭菌系统 2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统 3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统 由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图温度随时间的变化蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统温度随灭菌时间的变化由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌 优点： 1．不需附加设备 2． 蒸汽利用率高 3． 节约劳动力缺点 1． 培养基质量比较差 2． 罐的利用率低 3. 冷却水用量大连续灭菌 优点： 1 采用高温快速灭菌法 2．可以把培养基按其性质分开灭菌 3． 有利于自动控制 4． 节省冷却水缺点 1． 投资费用高 2． 对物料要求高 3． 蒸汽用量大选择原则：1． 培养基成份（易降解成分、液化情况等）2． 设备状况（冷却面积、传动装置等）3. 动力条件 四、高温对培养基成分的有害影响及其防止 消除高温有害影响的措施n（1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法 ）n（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时， 应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并 ；n（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先 作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷 酸盐沉淀；n（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基 （如含糖组合培养基）可进行低压灭菌第三节 空气除菌n一、无菌空气的要求 n1 .空气中的微生物• 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多， 也有酵母，霉菌孢子和病毒。

• 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰 尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为 103~104个／米3 • 灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气 除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1μm ）第三节 空气除菌n一、无菌空气的要求 n无菌空气的标准 百分数：99.99％ 美国联邦宇航局等级标准： 100级（直径小于0.5微米粒子数少于3.5个/L ） 温度：25 ℃—40℃ 湿度：30%—45% 1. 纤维或颗粒介质填充床过滤器： 棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、 维尼纶或活性炭等2.折叠式硼硅酸超细纤维过滤器： 超细玻璃纤维 3.烧结金属、陶瓷过滤器 n二 介质除菌：原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯 性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃 微生物截留在介质中，达到除菌的目的主要设备：填充床过滤器发酵生产中制备无菌空气的大致过程 空气空气介质除菌流程流程• 高空取气管是远离地面几十米 的管子一般而言，地面附近 空气中所含的 微生物和灰尘等 均比高空空气中含的多，据资 料介绍，每升高10米，空气中 杂菌可降低一个数量级，因此 从高空取气要比从低空取气有 利得多。

两级分离、冷却、加热的空气除菌流程 １——粗过滤器 ２——压缩机 ３——贮罐４——冷却器 ５——丝网分离器 ６——过滤器 高效前置过滤除菌流程高效前置过滤除菌流程 １——高效前置过滤器 ２——压缩机 ３——贮罐 ４——冷却器 ５——丝网分离器 ６——加热器 ７——过滤器 三 膜过滤（绝对过滤） 原理：利用微孔滤膜（microporous membrane）对空气进行过滤，膜的孔 径0.2-0.45微米，大于这一孔径的微生物 能绝对截留 膜过滤器 ：聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、 、聚丙烯、纤维素脂膜等。