杜仲的遗传多样性的研究进展-生物学硕士论文研究资料.doc

杜仲的遗传多样性的研究进展摘要：杜仲( Eucommia ulmoides Oliver) 为杜仲科落叶乔木，我国特有的第三纪孑遗植物，单科目、单种属植物，皮和叶等具药用保健价值和工业用途近几十年来，由于对杜仲资源的各种开发利用造成杜仲种质资源的严重破坏和丢失在此情况下，保护杜仲种质资源的遗传多样性及选择药用成分含量高、含胶量高、产皮量高、速生的优良树种则显得尤为重要文献检索结果表明目前杜仲的遗传多样性研究仍然处于一个较低的水平本文就遗传多样性的研究意义及方法进行了介绍，并提出研究杜仲遗传多样性的可行性的方法关键词：杜仲 遗传多样性 分子标记 DArT技术1 关于杜仲的概述（起源分布、经济价值、发展前景及存在问题）杜仲( Eucommia ulmoides Oliver) 又名丝连皮、扯丝皮、丝棉皮、玉丝皮、思仲等，为杜仲科落叶乔木，我国特有的第三纪孑遗植物，单科目、单种属植物，雌雄异株，异花授粉，分布于秦岭以南的陕西、四川、贵州、湖北、湖南等省，为国家二级珍贵保护树种 [1]根据自然地理特点及其经济性状和形态特征的差异，将杜仲分为7个分布区，即秦巴山区，大娄山区，鄂西山区，武陵山区，伏牛山－桐柏山－大别山区，浙、赣、皖交界山区，南岭山区，但各地理区域的生物学特性的差别不明显，因此认为不能根据生物学特性按地理区域进行分组 [2]。

杜仲浑身是宝，树皮自古便以名贵中药材而著称，具有明显的降压、提高机体免疫功能等药用价值[3-6]，杜仲叶具与杜仲皮同样的药用价值，目前已被用于营养保健产品开发的原材料 [7]，种子中含有大量的高级油 [8]，皮、叶、果实均含有杜仲胶，是天然橡胶生产的原材料 [9]，因此其可作为一种重要的经济树种近几十年来，由于对杜仲资源的各种开发利用，尤其是传统中药中主要以皮为主，收获方式以砍伐剥皮为主，造成杜仲种质资源的严重破坏和丢失在此情况下，保护杜仲种质资源的遗传多样性及选择药用成分含量高、含胶量高、产皮量高、速生的优良树种则显得尤为重要2 遗传多样性的研究意义及方法2.1 遗传多样性的研究意义生物多样性包括遗传多样性，物种多样性，生态系统多样性和景观多样性其中，遗传多样性是生物多样性的核心狭义地讲，遗传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的居群间和同一居群内不同个体间的遗传变异，亦称基因多样性 [10]物种的基本组成单位是个体，以居群的形式存在的个体对生境有着特殊的要求和选择，而居群间的个体可以通过自然交配互相交流基因，组成统一的繁育居群系统所以，同种的个体在遗传结构和表型特征上的差异不仅表现在分子水平上，也包括细胞、组织与器官直到物种个体性状等方面，从而体现了多样性的特征 [11]。

因此，物种的遗传多样性可以从形态特征，细胞学特征，生理生化特征及DNA序列特征等不同层次来标记区别研究遗传多样性对了解物种起源、预测种源适应性、估算基因资源分布、进行种质资源开发与利用、确定核心种质并保存、进行杂交育种的亲本选配等均具有重要意义2.2 遗传多样性的研究方法利用形态标记在多种植物上已构建了遗传图谱但此方法需要寻找或人工诱变突变体，这就使得构建形态标记的时间很长，并且这种标记易受环境的影响，更为重要的一点，突变对有利形态标记会产生不利影响 [12]细胞学标记主要是根据细胞染色体核型及带型特征进行的一种标记方法在植物核型分析中发现，不同种类的植物或不同种植物的核型通常不同，但种植于水平居群间及居群内，其核型的特征差别不明显，尽管对染色体进行带型分析，但植物染色体显带数量有限，在很大程度上限制了此方法的使用而后发展的同工酶标记法，因为其表现为共显性；需要的材料少，简便，在种子或幼苗期就可以进行检测；结果较为稳定在研究物种的起源演化和遗传多样性等方面取得了瞩目的成效 [13] 然而，同工酶是基因的表达产物，容易受外界环境因素和本身激素变化的影响，同时若待检测者的亲缘关系很近，往往不能提供足够的多态性标记，也限制了该标记在植物的遗传多样性研究中的应用。

基于DNA分子多态性建立起来的DNA分子标记方法，与以上几种遗传标记方法相比，它具有不受季节、环境、组织、器官及植物发育阶段的限制；不影响目标性状的表达；多表现为共显性，可以十分方便的对隐性性状进行选择；不受基因表达与否的限制；在基因组上分布广、数量多(几乎是无限的)；所需要的材料少等优点而被广泛应用限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)主要应用于居群水平、属内种间水平、科内属间水平物种的遗传变异、亲缘关系和分类等研究中RFLP法具有无表型效应、共显性标记的数目多而且稳定的特点，特别适合于构建遗传图谱但在操作过程中所需DNA量较大、操作步骤繁杂、多态性低、花费高等因素使其应用受到了限制 [14,15]随机扩增多态性(Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD) 技术程序简单、无需DNA探针、设计引物时无需预知DNA序列信息、分析所需DNA量少，能分析大量样品等优点，可用于检测种内遗传多样性、构建遗传图谱以及探索物种种属间亲缘关系等但此法为显性标记，重复性差 [16]扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphisms，AFLP）结合了RFLP和RAPD两者的优势，具有方便、不用Southern杂交、带纹丰富，灵敏度高、快速高效等优点，是目前应用较多的一种方法。

主要应用于遗传多样性、构建遗传图谱、鉴定品种、绘制指纹图谱、种群的分布及其进化关系等研究 [17]利用AFLP与ISSR结合分析了英国一种植物(Impatiens noli tangere)面临濒危的原因通过使用和验证，AFLP被认为是一种比较理想、有效的DNA分子标记方法，但其代价比较大，实验室操作的技术难度也比较大 [18,19]简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR)由于重复基数的数目变化大，SSR显示出较强的多态性，具有测定迅速、技术难度低、实验成本低等优点，使得它在植物的遗传分析中得以很快的应用但引物设计需要有DNA的序列信息，开发成本比较高现在的分子生物学技术最大的限制是分子标记的确定需要测序的结果，测序缓慢代价高而不能发现大量的覆盖全基因组的多态性标记，加上标记虽然确定了，但利用该标记检测个体基因型时，由于其受到依赖于凝胶电泳的限制，往往通量低、代价高，所获信息也有限 [20,21]3、杜仲的遗传多样性的研究进展杜仲是雌雄异株，异花授粉，长期采用天然杂交的种子繁殖，加上不同地理环境的长期栽培，产生了地理生态变异有人依树皮的特征将杜仲分为4个变异类型，即深纵裂、浅纵裂、龟裂和光皮 [22]。

也有人根据叶片形态特征分为长叶柄杜仲、小叶杜仲、紫红叶杜仲等，也有人根据枝条、果实的特征分成若干类型 [23]事实上这些分类标准受杜仲生长环境的影响根大，如土壤类型、降雨量、相对湿度、温度日照等，在实际应用中很难准确掌握由于杜仲的变异类型依上述标准难以掌握，而野生杜仲种群资源非常稀少，到目前为止通过AFLP法研究仅推测在神农架自然保护区有一杜仲古树可能为野生植株 [24]通过表现型观测也选择了一些优良树种，但从真正意义的遗传育种来说还相差甚远杜仲作为稀有的重要经济植物需要加以保护和研究利用，然而，杜仲的野生资源难以发现，在我国又分布于不同的省份，研究者依据不同形态特征或地理区域而将我国分布的杜仲分成若干类型，这些形态上的差异是由于生态条件造成的还是遗传性所决定的，目前还不知道，因为人们对杜仲的遗传多样性还不清楚利用现代分子生物学方法对杜仲的遗传多样性进行分析，将有利于杜仲优良树种的选择、资源保护和开发利用然而在此方面仅有很少的研究报道，利用RAPD分析认为杜仲种内具有丰富的遗传多样性，而不同居群内部的遗传多样性很低 [25]来自不同地区的杜仲样品的rDNA的ITS的同源性在96.9％以上,不能按照地区进行分组 [26]。

Deng等 [27]通过构建杜仲的富集AC基因组文库发展了23个SSR分子标记，对10个居群中36个个体进行检测，结果表明19个SSR具多态性，同一位点多态性最少有2个，最多可达到14个，杂合性变化范围在0.054-0.874之间，认为这些SSR标记可以作为研究杜仲居群遗传结构的有用工具相比于其他植物的遗传多样性研究，有关杜仲的遗传多样性研究还处于非常低级的水平，查阅相关文献，仅寥寥数篇 [24-28]，对杜仲的种质资源及遗传多样性研究结果也不够确定4、展望依赖于芯片杂交为基础发展起来的DArT（Diversity arrays technology）技术应用了微阵列平台技术相关原理，在大麦、小麦等遗传多样性和遗传图谱研究中已得到应用 [29-32] 贵州科技出版社，1993．12-13.[2]、陈品良等杜仲种质资源的现状及保护对策. 植物资源与环境， 1992，1（4）：6-11.[3]、徐诗论，曾庆卓，潘正英. 杜仲对细胞免疫功能的影响中草药， 1985，16（9）：5.[4]、徐诗论，周厚琼，黄武先等. 杜仲对机体非特异性免疫功能的影响 . 中草药，1983， 14（8）：27.[5]、李巨宝，李荣寰，王世发等. 杜仲不同炮制品的药效比较 .中药材，1986，6：33.[6]、王宇华，许惠琴，狄留庆，刘圣金. 生杜仲和盐杜仲对小鼠免疫功能的影响和抗疲劳作用研究. 中药药理与临床，2008; 24 (2)）.[7]、晏　媛，郭　丹. 杜仲叶的化学成分及药理活性研究进展，中成药，2003，25（6）：491-492.[8]、赵德义,徐爱遐,张博勇,等. 杜仲籽油与紫苏籽油脂肪酸组成的比较研究. 西北植物学报, 2005, 25:0191-0193.[9]、宋　磊，张学俊， 董大鹏， 王庆辉，杜仲胶性质及提取研究的进展 . 贵州化工，2006，31（4）：4-8.[10]、王洪新，胡志昂. 植物繁育系统、遗传结构和遗传多样性的保护 . 生物多样性，1996，4(2) ：92-96.[11]、李俊清，李景文，崔国发. 保护生物学. 中国林业出版社， 2002，17.[12]、周延清. 遗传标记的发展.生物学通报，2000，35(5): 17-18.[13]、Tanksley S D, Orton T. Isozyme in plant genetics and breeding (PartB). Amsterdam. Elsevier, 1983.[14]、Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. Comstruction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet,1980,3。