农作物组织培养.ppt

第八章第八章 主要农作物的组织培养主要农作物的组织培养1 ü以有性杂交为作为指导进行育种，这种方法局限性很大，而且周以有性杂交为作为指导进行育种，这种方法局限性很大，而且周期长期长ü植物组织培养已广泛应用于植物育种，在单倍体育种、胚培养、植物组织培养已广泛应用于植物育种，在单倍体育种、胚培养、体细胞杂交、细胞突变体筛选、遗传转化等方面体细胞杂交、细胞突变体筛选、遗传转化等方面ü离离体无性系的快速体无性系的快速繁殖繁殖ü培养培养无病毒无病毒种苗种苗ü 新品新品种的种的选育选育ü人工人工种子和种质的保存种子和种质的保存第一节第一节 农作物组织培养的意义、方法与应用农作物组织培养的意义、方法与应用2•对繁殖系数低的“名、优、新、奇、特”植物品种的推广，兰花、安祖花、马蹄莲、甘薯、草莓、香蕉、甘蔗、桉树、非洲菊等经济植物已开始工厂化生产•植物脱毒苗木培育植物脱毒苗木培育 脱毒后的马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉等植物可大幅度提高产量，改善品质，兰花、水仙、大丽花等观赏植物脱毒后植株生长势强，花朵变大，产花量上升，色泽鲜艳•植物新品种培育植物新品种培育 基因工程育种（抗虫棉、抗除草剂大豆、玉米），单倍体育种-烟草单育1号、水稻“中花8号”、小麦“京花1号”，远缘杂交幼胚早期培养，原生质体融合技术，选择细胞突变体•植物种质资源的离体保存植物种质资源的离体保存 超低温离体保存植物种质，可节约大量的人力、物力和土地，还可挽救那些濒危物种 3•人工种子人工种子 为某些珍稀物种的繁殖以及转基因植物、自交不亲为某些珍稀物种的繁殖以及转基因植物、自交不亲和植物、远缘杂种的繁殖提供有效的手段和植物、远缘杂种的繁殖提供有效的手段4第二节第二节棉花组织培养棉花组织培养•一、大量元素（一、大量元素（20倍）母液倍）母液 (g/L)5二、微量元素（二、微量元素（100倍）母液倍）母液 (g/L)微量元素二级母液（即我们平时配培养基时使用的微量）：取上述母液Ⅰ200ml，母液Ⅱ50ml，加蒸馏水定容至1L。

6•铁盐母液配制（所用试剂均为国药产品）铁盐母液配制（所用试剂均为国药产品）B5有机物配制有机物配制 （所用试剂均为（所用试剂均为sigma产品）产品）7各种激素配制（所用试剂均为各种激素配制（所用试剂均为sigmasigma产品）产品）89•愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 0.5-1cm的下胚轴切段接种于诱导培养基上，一个皿放25-30段下胚轴一个月后挑选两端膨大，生长正常的下胚轴继代到新的IBA培养基上•非胚性愈伤组织的增殖非胚性愈伤组织的增殖 由于愈伤组织的进一步膨大，一个皿中以20段下胚轴为宜•愈伤组织的分化愈伤组织的分化 愈伤组织经继代（一个月继代一次）几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上，进一步分化成胚状体•成苗生根培养成苗生根培养 将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上•炼苗移栽炼苗移栽 将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田10棉花下胚轴棉花下胚轴组织培养过程组织培养过程11棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的腺体处发生和外发生棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的腺体处发生和外发生•A1：下胚轴外植体；：下胚轴外植体；A2-A4：胚性愈伤组织在腺体处发生；：胚性愈伤组织在腺体处发生；B1：：愈伤组织表面的胚性细胞；愈伤组织表面的胚性细胞；B2-B4：愈伤组织表面形成胚性组织：愈伤组织表面形成胚性组织12棉花体细胞胚的单细胞起源和表面发生棉花体细胞胚的单细胞起源和表面发生•A：单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚：单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚(箭头所指箭头所指)；；B：具胚柄的多细胞原胚：具胚柄的多细胞原胚(箭箭头所指头所指)；；C：具胚柄的体胚；：具胚柄的体胚；D-G：与愈伤组织粘连的体胚；：与愈伤组织粘连的体胚；H-I：游离的体胚：游离的体胚13棉花单个胚性细胞团培养中体细胞胚的发生和发育棉花单个胚性细胞团培养中体细胞胚的发生和发育A：培养当天；：培养当天；B1-B2：培养：培养7 d；；C1-C3：培养：培养14 d；；D1-D3：培养：培养21 d后出现球形胚；后出现球形胚；E1-E3：心：心形胚阶段；形胚阶段；F1-F3：鱼雷形胚阶段；：鱼雷形胚阶段；G1-G3：子叶胚阶段：子叶胚阶段14棉花体细胞胚发育过程中的极性建立和组织分化棉花体细胞胚发育过程中的极性建立和组织分化A：球形胚表皮原形成；：球形胚表皮原形成； B：球形胚内层细胞分裂形成基础和维管组织；：球形胚内层细胞分裂形成基础和维管组织；C：内部等轴：内部等轴细胞轴向延长形成的心形胚；细胞轴向延长形成的心形胚；D-E：极性的逐步建立和原形成细胞层的分化；：极性的逐步建立和原形成细胞层的分化；F-G：具：具有清楚的前形成细胞层和极性的鱼雷形胚；有清楚的前形成细胞层和极性的鱼雷形胚；H：具有子叶原基，芽顶端分生组织、前：具有子叶原基，芽顶端分生组织、前形成层和根顶端分生组织的鱼雷形胚；形成层和根顶端分生组织的鱼雷形胚；I：具有：具有Y形微管组织的子叶胚形微管组织的子叶胚15棉花单个胚性细胞团培养中不同发育阶段的体细胞胚棉花单个胚性细胞团培养中不同发育阶段的体细胞胚A1-A6：球形胚；：球形胚；B1-B6：心形胚；：心形胚；C1-C6：鱼雷形胚；：鱼雷形胚；D1-D6：子叶胚：子叶胚16　　￿￿￿￿中国中国.中学政治教学网崇尚互中学政治教学网崇尚互联共享共享第三节第三节 水稻花药和花粉培养水稻花药和花粉培养17目录•研究进展•研究过程•研究意义•前景展望18一一 研究进展研究进展1.水稻单倍体获得途径水稻单倍体获得途径 花药培养、花粉培养花药培养、花粉培养 胚珠或子房培养（未受精）胚珠或子房培养（未受精）19概念：概念： 单倍体育种：单倍体育种：通过花药、花粉培养获得单倍体，然通过花药、花粉培养获得单倍体，然后进行染色体加倍，经过选择、鉴定选育出新品种后进行染色体加倍，经过选择、鉴定选育出新品种的途径。

的途径 花药培养：花药培养：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术进而分化成植株的技术 花粉培养：花粉培养：是将花粉从花药中分离出来是将花粉从花药中分离出来, ,接种到人接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的过程而分化成植株的过程20水稻花培历史：水稻花培历史： ▪ ▪19681968年，日本人新关和大野首次通过水稻花药培年，日本人新关和大野首次通过水稻花药培养获得单倍体植株；养获得单倍体植株； ▪ ▪19701970年，我国正式开展水稻花药培养技术研究，年，我国正式开展水稻花药培养技术研究，并取得良好进展；并取得良好进展； ▪ ▪截至目前，已有多个品种通过花培途径获得代截至目前，已有多个品种通过花培途径获得代表成果：天津农科院选育的花育表成果：天津农科院选育的花育“ “花育花育1 1号号” ”、、“ “花花育育2 2号号” ”；中国农科院选育的中花系列；黑龙江农科；中国农科院选育的中花系列；黑龙江农科院水稻所选育的龙粳系列品种。

院水稻所选育的龙粳系列品种21▪ ▪截至目前，通过花培选育出了很多粳稻品种并大面积的截至目前，通过花培选育出了很多粳稻品种并大面积的推广应用推广应用1975-19981975-1998共审定共审定2626个品种▪ ▪籼稻花药培养难度较大至籼稻花药培养难度较大至2020世纪末，共有世纪末，共有5 5个品种通过个品种通过花培选育花培选育22二二 研究过程研究过程•1.培养流程•2.培养方法•3.影响因素•4.检测方法231.培养流程培养流程花药和花粉培养基本流程：花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上胚状体转移至固化培养基上” ”萌发萌发” ”形成小植株形成小植株选择合适的供体植株选择合适的供体植株倍性鉴定或染色体加倍倍性鉴定或染色体加倍24252.培养方法培养方法•花药培养花药培养 1 1、取材、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。

宜的花蕾 2 2、消毒、消毒 7070％酒精擦洗花蕾表面，或％酒精擦洗花蕾表面，或7070％酒精浸泡％酒精浸泡30-60s30-60s后在后在1 1％次氯酸钠溶液中浸泡％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min10-20min或在或在0.10.1％％的氯化汞溶液中消毒的氯化汞溶液中消毒3-10min3-10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-53-5次 3 3、培养、培养 固体或液体培养基均可先进行脱分化培养，固体或液体培养基均可先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（形成突出物（2-32-3周）；后转入分化培养基培养，形成周）；后转入分化培养基培养，形成小植株26水稻花药培养由接种至长出愈伤图27•花粉培养花粉培养 与花药不同，花粉培养需进行花粉的分离与纯化及特殊的花粉诱导培养28分离和纯化方法分离和纯化方法1 1、自然散落法、自然散落法( (漂浮培养散落小孢子收集法漂浮培养散落小孢子收集法) ) 将花药接种将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。

在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养2 2、挤压法、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养3 3、机械游离、机械游离 （（1 1）磁搅拌法）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；粉游离出来； （（2 2）超速旋切法）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）4 4、小孢子纯化、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子过筛、梯度离心处理纯化小孢子29小孢子梯度离心前后比较小孢子梯度离心前后比较 梯度离心前梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）（小孢子形态、活力不一致） 30% 30%蔗糖梯度离心后蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）（获得均一的小孢子群体）30•花粉培养方式花粉培养方式1 1、平板培养、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。

花粉置琼脂固化培养基上培养2 2、液体培养、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气3 3、双层培养、双层培养 花粉置固体花粉置固体- -液体双层培养基上培养培养液体双层培养基上培养培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基加入少量液体培养基 4 4、看护培养、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育物质促进花粉小孢子发育5 5、微室培养、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养行花粉培养6 6、条件培养基培养、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养花药条件培养基、子房失活花药提取物的培养基上培养花药条件培养基、子房条件培养等条件培养等313.影响因素影响因素（（1）基因型）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。

同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反一同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大应差异较大 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻，且在同一亚种范围内，不同品种间也存在于糯稻，且在同一亚种范围内，不同品种间也存在很大差异很大差异32（（2）培养基和激素配比选择）培养基和激素配比选择 应用于水稻花培的基本培养基种类较多，应用于水稻花培的基本培养基种类较多， 如如N6N6、、 马铃薯培养基、马铃薯培养基、 L8L8、、 SK3SK3、、 土豆培养基、土豆培养基、MillerMiller、、 合合5 5、、 通用、通用、 LSLS、、 WhiteWhite、、 MSMS、、 M8M8和改和改良良M8M8等同一材料用不同的培养基培养，等同一材料用不同的培养基培养， 表现出表现出不同的花培效果不同的花培效果33 培养基培养基 三明市农科所生物技术中心以三明市农科所生物技术中心以M8M8、、 N6N6和和NBNB培养基，培养基， 进行了不同水稻品种材料花培观察比较试验，进行了不同水稻品种材料花培观察比较试验， 结果从出结果从出愈率、愈率、 绿苗分化率两者比较，绿苗分化率两者比较， 还是还是M8 M8 培养基较适合。

培养基较适合 冯双华等用冯双华等用M8M8、、 合合5 5和改良和改良M8M8做基本培养基，做基本培养基， 以籼以籼型杂交稻两优培九、型杂交稻两优培九、 培两优培两优288288、、 P88S/0293P88S/0293为材料，为材料， 得得出改良出改良M8M8培养基表现出对不同的基因型材料有较广的适培养基表现出对不同的基因型材料有较广的适应性和较强的绿苗诱导作用应性和较强的绿苗诱导作用34激素配比激素配比 生长素类一般有生长素类一般有2,4-D2,4-D、、 NAANAA、、 IAAIAA等，等， 细胞分裂细胞分裂素一般有素一般有6-BA6-BA、、 KTKT等使用倾向：复合激素使用倾向：复合激素 冯双华等提出籼型材料用冯双华等提出籼型材料用1.5 mg/L 2,4-D+1.5 1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/LNAAmg/LNAA诱导效果较好，诱导效果较好， 2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+0.25 mg/L IAANAA+0.25 mg/L IAA分化效果较好。

分化效果较好35 郭书巧等提出对籼粳交材料郭书巧等提出对籼粳交材料2 mg/L 2,4-D+1 mg/L 2 mg/L 2,4-D+1 mg/L NAA+0.2 mg/L KTNAA+0.2 mg/L KT为最佳的激素诱导配比，为最佳的激素诱导配比， 2.0 mg/L 2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT6-BA+0.5 mg/L KT分化效果较好分化效果较好 结论：基因型不同，最适激素配比不同一般认为，结论：基因型不同，最适激素配比不同一般认为，对籼型水稻采用复合激素较好对籼型水稻采用复合激素较好36（（3）田间取样与预处理）田间取样与预处理 取样时间取样时间取样时间取样时间：晴天：晴天8:00~10:008:00~10:00，， 或或16:00~18:0016:00~18:00 取穗标准取穗标准取穗标准取穗标准：：：： 穗苞大而不破，剑叶与下一叶的穗苞大而不破，剑叶与下一叶的 叶枕距为叶枕距为5~10 cm5~10 cm为宜为宜 低温处理低温处理低温处理低温处理：一般认为：一般认为5~85~8度条件下，度条件下， 低温预处理低温预处理8~10d8~10d较好较好 此外，还有其它处理方法：此外，还有其它处理方法：化学物质、射线、离化学物质、射线、离化学物质、射线、离化学物质、射线、离心心心心等。

等37（（4）培养条件）培养条件 温度、光照、密度384.检测方法检测方法1 1 1 1、染色体直接计数法、染色体直接计数法、染色体直接计数法、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目2 2 2 2、间接鉴定、间接鉴定、间接鉴定、间接鉴定（（1 1））扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中主要测定叶片单个细胞中DNADNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm21cm22 2）细胞形态学鉴定法）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性3 3）植株形态学鉴定法）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。

粒小，不结实39（（4 4）杂交鉴定法）杂交鉴定法 自交或测交鉴定，看后代分离情况自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞5 5）分子标记鉴定）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如和分子标记（如RFLPRFLP、、RAPDRAPD、、AFLPAFLP等）等）40三三.研究意义研究意义 1.缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而花培仅需一年供体植株供体植株小孢子小孢子（（n n））花培花培花粉植花粉植株株（（n n））雄核发育雄核发育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍纯合植株纯合植株DHDH（（2n2n））一年内获得纯系一年内获得纯系412.提高了目标基因型的选择效率例子：例子： 二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBbAaBb，若要从后代中选择基因为，若要从后代中选择基因为AAbbAAbb的纯合单株的纯合单株 常规方法常规方法：： AAbbAAbb出现的概率为出现的概率为1/161/16，并且不能将，并且不能将AAbbAAbb与与AabbAabb、、aAbbaAbb区分开。

区分开ABABaBaBAbAbababABABAABBAABBAaBBAaBBAABbAABbAaBbAaBbaBaBaABBaABBaaBBaaBBaABbaABbaaBbaaBbAbAbAabBAabBAabBAabBAAbbAAbbAabbAabbababaAbBaAbBaabBaabBaAbbaAbbaabbaabb422.提高了目标基因型的选择效率例子：例子： 二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBbAaBb，若要从后代中选择基因，若要从后代中选择基因为为AAbbAAbb的纯合单株的纯合单株 单倍体方法单倍体方法：： AAbbAAbb出现的概率为出现的概率为1/41/4 单倍体单倍体单倍体单倍体 二倍体二倍体二倍体二倍体AB-AB------ --------------------> ----- --------------------> AABBAABBaBaB----------------------------> ----------------------------> aaBBaaBBAbAb---------------------------->----------------------------> AAbbAAbbab-- -------------------------->ab-- --------------------------> aabbaabb供体亲本供体亲本AaBbAaBb花培花培433.有利于隐性基因控制性状的选择4.与生物工程技术结合，对育种学及遗传基础研究都有很重要的意义。

44四四.前景展望前景展望1.1.供体植物生长条件的进一步提高和离体培养方法的供体植物生长条件的进一步提高和离体培养方法的改进，有可能最终消除或大大减少花培药养基因型改进，有可能最终消除或大大减少花培药养基因型的限制2.2.花药或小孢子培养体系做为基因转导的靶组织，可花药或小孢子培养体系做为基因转导的靶组织，可以实现稳定的转化，外源基因在后代中不易丢失或以实现稳定的转化，外源基因在后代中不易丢失或发生致命的突变，是很有前途的研究领域发生致命的突变，是很有前途的研究领域45 19991999，美国洛克菲勒基金会的，美国洛克菲勒基金会的，美国洛克菲勒基金会的，美国洛克菲勒基金会的ToneesonToneeson在在在在Science Science 撰文指出，撰文指出，撰文指出，撰文指出，现代生物技术育种的两大支柱是基因工程现代生物技术育种的两大支柱是基因工程现代生物技术育种的两大支柱是基因工程现代生物技术育种的两大支柱是基因工程育种和与分子标记相结合的加倍单倍体育种（育种和与分子标记相结合的加倍单倍体育种（育种和与分子标记相结合的加倍单倍体育种（育种和与分子标记相结合的加倍单倍体育种（DHDH育种）育种）育种）育种），，，，后者效率高，成本低，特别适合于发展中国家的国后者效率高，成本低，特别适合于发展中国家的国后者效率高，成本低，特别适合于发展中国家的国后者效率高，成本低，特别适合于发展中国家的国情。

情46第四节第四节 玉米组织培养玉米组织培养47主要内容：主要内容：•植物组织培养的意义植物组织培养的意义. •玉米组织培养的目的玉米组织培养的目的. •研究进展研究进展.•目前玉米组织培养的主要目前玉米组织培养的主要方法方法.48 植物组织培养的意义植物组织培养的意义•植物组织培养可以生产大量的优良无性系植物组织培养可以生产大量的优良无性系. •细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍杂交不亲和性障碍. •可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体整倍体.•组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料分析研究的理想材料.49玉米组织培养的目的玉米组织培养的目的•玉米组织培养的目的是让外植体能够高频玉米组织培养的目的是让外植体能够高频率地诱导出愈伤组织，建立高效率地诱导出愈伤组织，建立高效 的体细胞的体细胞再生体系再生体系 ，为玉米遗传转化和细胞工程研，为玉米遗传转化和细胞工程研究创造有利条件究创造有利条件 50玉米组织培养的研究回顾玉米组织培养的研究回顾•Larue在在 1949年用甜玉米的胚乳作外植体年用甜玉米的胚乳作外植体，，首次诱出玉米愈伤组织首次诱出玉米愈伤组织，，但未获得再生植株但未获得再生植株 。

•1975年，年，Green和和Phillips首次用首次用A188的幼胚作的幼胚作外植体外植体，，诱导出二倍诱导出二倍 体体 愈伤组织愈伤组织 ，并再生，并再生得得 到第一株无性系植株到第一株无性系植株51玉米组织培养的研究现状玉米组织培养的研究现状•现在已经能从多种外植体中诱导出愈伤组现在已经能从多种外植体中诱导出愈伤组织，并再生出植株例如：幼胚、花织，并再生出植株例如：幼胚、花 药、药、幼穗等，其中幼胚是最易诱导，也是目前幼穗等，其中幼胚是最易诱导，也是目前最常用的外植体最常用的外植体52玉米组织培养的主要方法（简介）玉米组织培养的主要方法（简介）1、、玉米花粉和花药组织培养玉米花粉和花药组织培养 玉米花粉和花药的培养一般可获取单倍玉米花粉和花药的培养一般可获取单倍体植物，有利于促进玉米遗传育种工作的体植物，有利于促进玉米遗传育种工作的有效进展有效进展532、、 玉米茎尖和根尖离体培养玉米茎尖和根尖离体培养 玉米植株的根尖和茎尖分生组织具有良好的玉米植株的根尖和茎尖分生组织具有良好的分化性能玉米茎尖和根尖离体培养有利分化性能玉米茎尖和根尖离体培养有利于促进完整玉米植株的生长于促进完整玉米植株的生长,并且在取材上并且在取材上不受季节限制。

不受季节限制543、、玉米幼胚的组织培养玉米幼胚的组织培养 玉米幼胚属于二倍体，玉米幼胚属于二倍体， 且分生能力较强且分生能力较强幼胚是最易诱导，幼胚是最易诱导， 也是目前最常用的外植体，也是目前最常用的外植体， 但幼胚取材的时间受到严格的季节限制但幼胚取材的时间受到严格的季节限制55玉米幼胚组织培养的全过程玉米幼胚组织培养的全过程1、、准备工作准备工作•接种室消毒接种室消毒•准备诱导培养基（准备诱导培养基（N6+肌醇肌醇+L-脯氨酸脯氨酸1.38g/L+蔗糖蔗糖30g/L+琼脂琼脂7g/L+水解酪蛋白水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D2mg/mL)•灭菌灭菌562、、外体消毒及挑幼胚外体消毒及挑幼胚 75%酒精擦玉米外层叶片酒精擦玉米外层叶片 至超净工作台，至超净工作台，用用75%酒精擦玉米外层叶片，剥一层擦一层至酒精擦玉米外层叶片，剥一层擦一层至完完 用刀去掉用刀去掉1/3玉米籽粒玉米籽粒 挑幼胚挑幼胚 接种到准备好的诱导培养基上接种到准备好的诱导培养基上（暗培养）（暗培养）573、、继代继代• 准备继代培养基准备继代培养基(N6+水解酪蛋白水解酪蛋白0.1g/L+L-脯氨酸脯氨酸0.69g/L+甘露醇甘露醇20g/L+蔗糖蔗糖30g/L+琼脂琼脂6.5g/L+2,4-D1mg/ml)•诱导两次后，转入继代培养基每诱导两次后，转入继代培养基每7天继代一天继代一次，直至出透明、黄色、坚硬的愈伤组织，次，直至出透明、黄色、坚硬的愈伤组织，可用于转化可用于转化（一般继代三次（一般继代三次））584 4、转化、转化•侵染培养（侵染培养（22--25℃℃，暗培养，暗培养3天）天）•恢复培养（暗培养恢复培养（暗培养3天）天）•筛选培养筛选培养•分化培养分化培养•生根培养生根培养•壮苗壮苗595、移栽及管理、移栽及管理•移栽前，应对移栽用的基质进行灭菌。

移栽前，应对移栽用的基质进行灭菌•移栽前，可将培养物不开口移到自然移栽前，可将培养物不开口移到自然 光照下锻炼光照下锻炼2-32-3天，然后再开口练苗天，然后再开口练苗1-1-2 2天，以适应将来自然湿度的条件天，以适应将来自然湿度的条件•玉米组培苗移栽时首先应把根部的培玉米组培苗移栽时首先应把根部的培养基清洗干净，以免受细菌或真菌污养基清洗干净，以免受细菌或真菌污染而影响幼苗生长染而影响幼苗生长•移栽移栽60玉米茎尖组织培养的全过程玉米茎尖组织培养的全过程1、、准备工作准备工作•接种室消毒接种室消毒•准备培养基（准备培养基（MS+蔗糖蔗糖30g/L+琼脂琼脂6.5g/L)•灭菌灭菌611 1、玉米种子消毒、玉米种子消毒a)a)在在500ml500ml三角瓶中装入三角瓶中装入200—300200—300粒玉米种子粒玉米种子b)b)用用75%75%酒精清洗酒精清洗8min8minc)c)0.1%0.1%升汞升汞5min5mind)d)无菌水洗无菌水洗2 2遍遍e)e)加入无菌水静置加入无菌水静置8h8hf)f)0.1%0.1%升汞升汞8min8ming)g)无菌水洗无菌水洗5 5遍遍h)h)装入钣盒装入钣盒i)i)28℃28℃暗培养暗培养3 3天天622、接种、接种• 取出培养三天后的种子，接种到取出培养三天后的种子，接种到MS固体固体培养基中，根向下伸入培养基中，芽向上，培养基中，根向下伸入培养基中，芽向上，芽萌发得不太好的继续放进饭盒中再培养。

芽萌发得不太好的继续放进饭盒中再培养•接种到接种到MS固体培养基中的芽放回固体培养基中的芽放回28℃℃暗培暗培养养3-4天633 3、玉米茎尖转化、玉米茎尖转化•取出取出MS固体培养基中的芽放在无菌滤纸上固体培养基中的芽放在无菌滤纸上•切根切根64•镊子夹胚轴，在茎尖处用刀尖切半边镊子夹胚轴，在茎尖处用刀尖切半边65•在茎尖生长点划一小口在茎尖生长点划一小口66•转化后，接种于转化后，接种于MS培养基中，进行暗培养培养基中，进行暗培养673、移栽及其管理、移栽及其管理 培养培养3—5天后，将其移栽至至花盆中，其天后，将其移栽至至花盆中，其 中注意事项与前面的相同后期的管理也中注意事项与前面的相同后期的管理也于前者相近于前者相近 68第五节 马铃薯的脱毒培养目的要求: (1)掌握马铃薯脱毒培养的大致过程，了解马铃薯脱毒苗的鉴定方法; (2)掌握马铃薯的生物学习性： (3)熟悉微型薯的生产过程69微型薯7071 马铃薯是一种全球性的重要经济作物适应性广，营养价值高，耐贮藏适运输，既是一种重要的粮食作物也是一种调节市场供应的重要蔬菜。

马铃薯原产于拉丁美洲，当被发现可以食用后，很快传到世界各地，成为栽培很广的一种作物72但是，当发现从外地引种栽培1~2个周期后，明显发现产量降低，植株变矮，并有卷叶的现象产生，经检测证明这是由于病毒引起的退化现象 73 危害马铃薯的病毒有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等由于马铃薯是无性繁殖作物，病毒逐代积累，日益严重，引起严重退化马铃薯病毒可使块茎产量减少50%~80%74法国Morel和他的同事们，1955年从患病马铃薯植株中选取到了无病植株，为治疗作物病毒开辟了新途径 75一、特性和生物学习性1、马铃薯的形态特性(1)根 马铃薯的根系由初生根和匍匐根两部分组成2)茎 马铃薯分地上部分和地下部分，地上主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎76（3）叶 马铃薯先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形以后发生的叶奇数羽状全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶4）花 马铃薯的花为聚伞花序，第一或第二花序开放，恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。

(5) 果实、种子 马铃薯果实为球形或椭圆形浆果扁平肾形种子可用来繁殖，但后代性状分离大772、 生物学习性马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4℃下发芽，发芽适温为12~18℃地上茎叶生长温度为17~21℃，25℃以上时生长不良，叶变小，超过30℃和7℃以下茎叶停止生长，-1℃时受冻块茎形成要求昼温14~24℃，夜温12~14℃，土温16~18℃土温20℃以上时块茎形成缓慢，而且容易引起退化，高温下养分多用于芽和匍匐茎生长不易形成块茎，25~30℃时已经长成的块茎也变成细长茎，结薯期要求12h左右的短日照和疏松、湿润、肥沃以及通气良好的土壤条件土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整78马铃薯生产中普遍存在有种性退化问题，表现为植株长势衰弱，株形矮化，分枝变少，薯块变小，产量逐降低，造成退化的原因和学说多种，综合而言，主要是薯块生长锥细胞发生阶段性衰老而导致种性退化，而病毒和细菌病害的侵染，以及肥水、营养条件不良等都会加剧其退化程度 79二、马铃薯脱毒技术马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成减产50％以上。

研究发现，有30多种病毒易感染马铃薯，并引起品种退化，严重影响马铃薯的生产通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒80因此，采用组织培养技术，通过一定良种繁殖体系，生产优质种薯，是保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施81全国现有马铃薯播种面积300多万公顷，且有逐步增加的趋势，每年需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型薯45亿粒因此，脱毒马铃薯推广具有广阔的市场前景，对于增加农民收入和发展马铃薯产业化生产具有十分重要的意义82我国的马铃薯平均单产仅为13.60吨/公顷，是世界单产最高国这瑞士（48.80吨/公顷）的1/4造成如此大的差别，最主要的因素就是种薯质量差，品种布局不合理采用脱毒快繁技术，种用脱毒种薯，一般可增产30-50%，甚至成倍增产，充分发挥品种的潜能，提高马铃薯生产能力如果我国现有马铃薯播种面积的1/3（即114万公顷）用脱毒种薯，就可年增产粮食100多亿公斤83我国在70年代用茎尖组织培养方法得到脱毒马铃薯试管苗，并成功地获得脱毒复壮的马铃薯，开始了脱毒种薯的生产和推广"八五"期间，农业部在全国范围内设立了6个马铃薯原原种基地建设和种薯生产项目，初步形成了脱毒草种薯生产体系。

共推广脱毒种薯36.5-40万公顷，获经济效益近30.8亿元 84我国已有许多科研、推广单位开展了脱毒马铃薯的研究和生产，在生产上产生了一定的经济效益和增产效果，但由于长期以来各自为政，技术方法和脱毒标准不尽统一，未能发挥出脱毒种薯应有的增产潜力到目前为止，我国仍未建立国家级的脱毒种薯质量监督和病毒检测制度 851．脱毒种薯生产程序采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗86试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代87882．茎尖培养脱毒（1） 取材和培养一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗干净，无菌条件下先用70％的酒精浸润组织15-20秒，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡4--5min，然后用无菌水冲洗3次 89把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留1-2个叶原基，0.2—0.3毫米，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgNAA 、 0.2mgGA3、0.5mgBA，2%蔗糖，p H值5.8。

90培养条件：21~25℃、2000-3000 lx、12h/d2-3周愈伤，4-5周绿点，3--6月长成2-3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉91（2） 继代和生根培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISA（试剂盒）鉴定后（试管苗应每3月检测一次，每年4次）鉴定后，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁取试管苗单节切段扦插在（或平放）固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20d左右发育成5~10cm高小植株，继续进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5~8倍，试管苗多接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养92培养基：MS+NAA0.2-0.5+D-泛酸钙10，3%蔗糖，20-25度，3000-4000LX，14-16小时光照，每3周继代一次，单芽茎段约1厘米，可插也可平放，原则试管苗用2年—3年 9394(3) 驯化 为增强试管苗对温室内环境条件的适应能力，移植前对试管苗要进行光、温锻炼炼苗期温室内的温度：白天23~27℃，夜间不低于14℃炼苗的具体方法是：移植前7d左右，将长有3~5片叶、高2~3cm的试管苗，在不开瓶口的状态下，从培养室移至温室排好为防止强光、高温灼伤试管苗，在温室顶上加盖一层黑色遮阳网。

953. 脱毒苗切繁　 基础苗成活进入正常后便可切繁，但切繁量的多少和质量的高低，除与前边提到的水与温湿度条件有关外，能否掌握正确的切繁方法和适宜的切繁苗龄也是非常重要的脱毒苗切繁主要是剪取顶部芽尖茎段（主茎芽尖和腋芽芽尖）直接扦插 9697微型薯生产：网室内，铺6厘米蛭石，3%撒可富稀释一倍，喷潮湿即可插前浇水湿润，插后浇透覆膜一周（但不要压紧），湿度80%以上，期间喷水2次揭膜后喷营养液撒可富3%，喷水冲洗（每周2次），每周喷一次0.5%硫酸铜（叶面），中后期喷药防病，防早疫、晚疫病，连续喷2-4次喷辛硫磷防害虫苗高6—8厘米培蛭石防绿薯，1-2厘米厚，约35-40天出现气生薯，不断盖蛭石9899四、马铃薯无病毒苗的鉴定材料1、指示植物鉴定在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定是最常用的方法，Ｘ病毒、Ｓ病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种2、鉴定寄主的准备马铃薯常用的鉴定寄主植物有苋科的千日红，茄科的洋酸浆、毛曼佗罗等寄主植物应在无虫网室中培养100３.接种液制备及接种叶片洗净后在消毒的研钵中研成糊状，用纱布滤出汁液，再用蒸馏水稀释１０倍作为接种物，在鉴定寄主植物的叶面，６００目的金刚砂混入接种物中，然后用左手心紧靠在寄主的背面，以右手实指蘸取接种液，均匀的在叶背面擦过，以不造成叶片产生伤痕为度，最后把叶面上多余的接种物用清水冲洗干净，放置在１５～２４的防虫室中，一般５－１０天可发病。

101五、马铃薯无病毒株的繁殖和保存1．无病毒株的繁殖通过茎尖培养只能得到很少的无病毒植株，而生产上需要数以万计的健康种薯同时无病毒植株并没有对该病毒获得免疫能力，仍会在繁殖中再次侵染如何在以后繁殖中防止受病毒再侵染是很关键的一环目前在生产上来用的方法很多，下面介绍主要的几种102（１） 直接块茎繁殖（２） 扦插繁殖（３） 组织培养切段繁殖 A：继代培养 B：低温保存103复习思考题（１） 对马铃薯脱毒苗的培养大致分几个阶段？各阶段是怎样操作的？（２） 马铃薯的生物学习性有哪些？104。