焦磷酸测序包括哪些.docx

焦磷酸测序包括哪些 3.焦磷酸测序技术为什么能正确测定DNA的序列 Pyrosequencing是一项2113全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短5261的目标片段其4102基本原理如下： 第1步：1个特异性的测序1653引物和单链DNA模板结合，然后参加酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin） 第2步：向反应体系中参加1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi） 第2步图示（图片来自互联网） 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比 第3步图示（图片来自互联网） 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。

第4步图示（图片来自互联网） 第5步：参加另一种dNTP，使第2-4步反应重复开展，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息 第4步图示（图片来自互联网） Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域 4.二代测序与焦磷酸测序有什么关系 焦磷酸测序技术应用存在的问题：该技术的原理上来讲，对于多个单碱基重复的序列的准确性比较低（因为焦磷酸测序是一次参加一种碱基，所有荧光信号区分AAAA中到底有几个A是比较不准确的）通量低，当然这个是市场所给定义的，以前illumina测序GA的时候，也没觉得其他通路有多低，但是现在PGM,next500 MISEQ,HISEQ 这一些列的测序的通量大大提高，使得其他通量显得应用中很难有发挥，现在出来种群多样性鉴定中还比较好用（说实话也被miseq给占了一半还多），454越来越少了 其实焦磷酸测序这个技术应用在非二代测序中也有一定应用，比方甲基化的验证（现在焦磷酸测序是甲基化位点验证的金标准） 第 3 页 共 3 页。