食品内外部因素对金属抗菌肽SIF4抑菌活性影响及生物相容性分析.docx

    食品内外部因素对金属抗菌肽SIF4抑菌活性影响及生物相容性分析    肖怀秋，李玉珍，林亲录，赵谋明，曹丹1(湖南化工职业技术学院 制药与生物工程学院，湖南 株洲，412000)2(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州，510000)3(中南林业科技大学 食品科学与工程学院，湖南 长沙，410004)为使食品免受食源性致病菌或腐败微生物污染并延长食品保质期，除采用低温、高盐(糖)或干燥等传统手段外，常在食品中添加抗菌保鲜剂以达到预期目的化学防腐剂因易残留和存在潜在“三致”危害而受限[1]抗菌肽因具有抗菌谱广、抑菌机制独特和不易产生耐药性等优势而成为食品抗菌保鲜领域的研究热点食品是一个复杂多变的非线性灰色体系，食品组分、加工参数及贮运条件等内外部因素对抗菌活性发挥可能产生复杂影响食品酸碱性及表面活性剂等可影响抑菌活性，如Nisin在酸性食品中可发挥较好抑菌活性，而中性或碱性条件则几乎无抑菌活性，酸处理能显著降低辣椒籽抗菌肽抑菌活性[2]，Tween-80能增强抗菌能力[3]食品中金属阳离子对抗菌活性也可能产生复杂影响，如Fe2+使BSN-37抑菌活性消失[4]、Ag+使萝卜籽蛋白抑菌活性降低70%[5]、Ca2+可增强花椒籽蛋白抗菌活性[3]，Na+、Mg2+和Ca2+使BSN-37最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)上升6倍以上，Fe3+使MIC轻微下降[6]。

前期研究发现，金属抗菌肽SIF4对金黄色葡萄球菌[7]和大肠杆菌[8]有较好抑菌活性，在模拟食品体系中保持较好抗菌活性[9]，但在食品内外部环境因素变化时抗菌活性衍变规律尚未明晰本文以金黄色葡萄球菌为指示菌，研究食品内外部环境因素变化对SIF4抑菌活性影响的衍变规律，为其在食品抗菌保鲜中应用提供理论支撑1 材料与方法1.1 材料与设备金属抗菌肽SIF4由课题组制备[7]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC25923)，从菌种保藏中心获得牛肉膏、胰蛋白胨，北京博星生物；胃蛋白酶、胰蛋白酶，庞博生物；蛋白酶K，Sigma；其他试剂均为国产分析纯Infinite M200 Pro多功能酶标仪，Tecan；LDZX-40SAI立式蒸汽灭菌锅，上海博迅医疗；BBS-SSC超净工作台，济南腾览；DH-360电热恒温培养箱，北京科伟；HERMLEZ323K冷冻离心机，Hermle1.2 实验方法1.2.1 相对抑菌活性测定从菌种保藏斜面用接种环刮取2环S.aureus接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃恒温振荡(120 r/min)培养至对数生长期，准确吸取0.1 mL菌液(×108CFU/mL)均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基表面，将灭菌牛津杯置于培养皿中并加入供试品0.1 mL，4 ℃放置2 h使试液充分扩散至琼脂层，37 ℃ 恒温静置培养24 h并测定抑菌圈直径。

抑菌活性计算如公式(1)所示：(1)式中：A1为试验组平均抑菌圈直径，cm；A0为对照组平均抑菌圈直径，cm1.2.2 食品内部因素对抑菌活性的影响(1)温度对抑菌活性的影响：取2×MIC的SIF4(MIC=0.2 μg/mL)5 mL，于25、37、50、60、70、80、90、100、121 ℃分别处理30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合(SIF4终浓度为1×MIC，下同)并测定相对抑菌活性2)pH变化对抑菌活性的影响：参考WU等[10]方法并略作修改取2×MIC SIF4若干份，用1 mol/L HCl或NaOH将pH调至2～12，室温放置1 h，pH回调至7.0，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性3)金属阳离子对抑菌活性的影响：参考BOZIARIS等[11]方法并稍微修改取SIF4若干份溶于0～200 mmol/L CaCl2、MgCl2、KCl和NaCl溶液(pH 7.4)中，使终浓度为2×MIC，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。

1.2.3 食品外部因素对抑菌活性的影响蛋白酶对抑菌活性的影响：参考KIM等[12]方法并略作修改于2×MIC SIF4溶液中分别加入胃蛋白酶(37 ℃，pH 1.5)、胰蛋白酶(37 ℃，pH 8.5)和蛋白酶K(55 ℃，pH 7.5)，使酶终质量浓度分别为0.001、0.01、0.1、1 mg/mL，温育30 min后100 ℃灭酶5 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性反复冻融对抑菌活性的影响：将2×MIC SIF4进行反复冻融(-20 ℃冻结，常温解冻，冻融10次)，冻融后于5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性化学试剂对抑菌活性的影响：(1)EDTA对抑菌活性的影响：配制浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/mL无菌EDTA溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性2)Tween-80对抑菌活性的影响：配制质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL无菌Tween-80溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。

3)尿素对抑菌活性的影响：配制浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的无菌尿素溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性4)十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)对抑菌活性的影响：配制质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL无菌SDS溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性1.2.4 生物相容性分析(溶血活性分析)参考STARK[13]方法并修改取健康家兔血液收集于肝素钠管中，2 000 r/min离心10 min，倒掉血清，血细胞用预冷PBS(10 mmol/L，pH 7.4，含50 mmol/L NaCl PBS)重悬洗涤3次以除尽血清，血细胞用PBS重悬至8%将1 024 μg/mL SIF4作2倍稀释并分别与等体积血红细胞悬液混合，37 ℃孵育30 min，3 000 r/min离心10 min，1 000 r/min离心10 min后，上清液用多功能酶标仪测定A490nm以观察红细胞血红蛋白释放程度。

以PBS为阴性对照，0.1% Triton X-100为阳性对照溶血活性计算如公式(2)所示：(2)式中：A1为抗菌肽和样品共育后吸光值；A0为阴性对照组吸光值；A2为阳性对照组吸光值1.2.5 试验数据处理试验结果以平均值±标准偏差(n=3)表示，用Origin 2017绘制统计图，采用SPSS 25.0单因素ANOVA检验进行组间均数差异多重比较，两两比较方差齐性时采用最小显著性差异法，非齐性时使用塔姆黑尼T2方法，显著性水平α=0.052 结果与分析2.1 食品内部因素对抑菌活性的影响2.1.1 温度对抑菌活性的影响温度对SIF4抑菌活性影响结果如图1所示由图1可知，金属抗菌肽SIF4抑菌活性在25～70 ℃无显著差异(P>0.05)，80 ℃后略有下降，121 ℃ 仍保持(92.68±0.40)%抑菌活性，说明SIF4经不同温度处理后，对金黄色葡萄球菌抑菌活性并未发生明显变化，具备较好热稳定性，可能是由于SIF4为小分子抗菌肽，高温处理对结构影响甚微[14]，与朱张洪基[15]报道的SDLH抑菌蛋白热稳定性结论相悖，该抑菌蛋白常温表现较好抑菌活性，高温(50～80 ℃)稳定性较差，可能是由于该抑菌蛋白分子质量较大，高温处理破坏氢键，对空间结构产生影响，从而减弱抑菌活性，多数蛋白在45～50 ℃发生变性，而寡肽热稳定性相对较好[15]。

图1 温度对抑菌活性的影响Fig.1 The effect of temperature on antimicrobial activity注：字母相同表示组间差异不显著(P>0.05)，字母不同表示组间差异显著(P<0.05)(下同)2.1.2 pH变化对抑菌活性的影响pH对SIF4抑菌活性影响结果如图2所示由图2可知，在pH 2～9，SIF4抑菌活性可保持在(93.98±0.30)%以上，说明SIF4在酸性、中性或偏碱性条件下有较好抑菌稳定性，可用于果蔬汁饮料等酸性食品抗菌保鲜pH>10抑菌活性显著降低可能是由于强碱性环境下抗菌肽分子构象发生变化而影响其抗菌稳定性[16]研究发现，pH=12时仍保持(85.54±0.28)%抑菌活性，说明SIF4具有较好酸碱适应性，在不同食品pH体系中具有较好的应用基础鸭小肠抗菌肽在pH=7.0时抑菌活性最强，适用于中性食品体系，偏酸性(pH8.0)食品体系抑菌效果均不理想，林蛙抗菌肽在pH 2～5.6稳定，pH>6抑菌活性明显下降，pH 8左右出现沉淀，适用中性或酸性食品体系，而辣椒籽抗菌肽在pH≥7时，抗菌活性随pH升高而显著升高(P图2 pH值对抑菌活性的影响Fig.2 The effect of pH value on antimicrobial activity2.1.3 金属阳离子对抑菌活性的影响金属阳离子对SIF4抑菌活性影响如图3所示。

由图3-A可知，50～200 mmo/L Ca2+对SIF4抑菌活性无显著影响(P>0.05)李心丹等[17]发现，抗菌肽抑菌活性随Ca2+浓度增加而显著减弱(P0.05)，抑菌活性均保持在(99.28±0.78)%以上Mg2+对花椒籽抗菌肽有显著抑制作用且与离子浓度呈正相关关系[16]，抗菌肽VR3在高浓度Mg2+时抑菌活性减弱近40%，且Mg2+比Na+抑菌活性更明显[18]；由图3-C可知，K+在50～200 mmol/L，试验组与对照组抑菌活性均无显著差异(P>0.05)，与李心丹等[17]结果一致，但与侯晓艳[16]结论不一致，她发现高浓度K+浓度时，NP-5抑菌活性下降了38.46%；由图3-D可知，在50～200 mmol/L Na+，试验组与对照组抑菌活性无显著差异(P>0.05)，与钟亨任[19]结果一致结果表明，SIF4抑菌活性不受Na+、K+、Ca2+和Mg2+影响，可能为非金属依耐抗菌肽[20]2.2 食品外部因素对抑菌活性的影响2.2.1 蛋白酶对抑菌活性的影响蛋白酶对SIF4抑菌活性影响如图4所示A-胃蛋白酶；B-胰蛋白酶；C-蛋白酶K图4 蛋白酶对抑菌活性的影响Fig.4 The effect of proteinase on antimicrobial activity由图4-A可知，胃蛋白酶处理后抑菌活性与对照组无显著差异(P>0.05)，说明SIF4具有较好的胃蛋白酶耐受性。

侯晓艳[16]发现，胃蛋白酶可显著降低NP-2、NP-5和NP-6抑菌活性，coagulin甚至可被胃蛋白酶失活[21]胃蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸，倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸和亮氨酸的肽键，SIF4具有较好的胃蛋白酶耐受性可能与其金属螯合载体相对。