血液MICM诊断.ppt

血液血液MICM诊断断背景介背景介绍 血液病是原血液病是原发于造血系于造血系统的疾病，或影响造血系的疾病，或影响造血系统伴伴发血液异常改血液异常改变，以，以贫血、出血、血、出血、发热为特征的疾病特征的疾病 出血性疾病出血性疾病贫血症血症白白细胞胞疾病疾病常常见血液病血液病造血系造血系统恶性性肿瘤瘤白血病的白血病的诊断分型断分型MICM•FAB形态学诊断(Morphology)•免疫学检查(Immunology )•细胞遗传学检查(Cytogenetics)•分子遗传学检查(Molecular)检测方法方法–病史–形态学： •结构：活检•细胞学：涂片•骨髓血凝块–免疫分型：•流式细胞或免疫组化–细胞遗传学：核型分析、FISH–分子遗传学：融合基因（RT-PCR\Q-PCR)/基因突变（测序）白血病白血病MICM诊断程序及技断程序及技术白血病白血病诊断的任断的任务—不不仅仅是是FAB分分类•是不是白血病？•急性？慢性？•系来源•FAB分类•预后分层•治疗、疗效判断•MRD 病史病史+形形态形形态+免疫免疫形形态+免疫免疫+遗传+分子分子形形态+免疫免疫+遗传+分子分子为什么需要什么需要MICM综合合诊断？断？Ø￿形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅50-70%；Ø￿在此基础上增加免疫组化和/或FCM分析大大增加了分型的准确率，可达90%以上；Ø￿染色体、FISH及基因分析，进一步提高分型的准确率 MICM整合整合诊断的断的临床意床意义•￿全面正确诊断与分型•￿评估预后•￿确立检测MRD的标志，追踪MRD• 帮助建立分层、个性化的治疗•￿定期追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变•￿帮助确定病因或发病机制MICM整合整合报告告形形态学学￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿是是诊断的基断的基础，任何淋巴造血系，任何淋巴造血系统增生性疾病增生性疾病的的诊断都离不开形断都离不开形态学学诊断。

形断形态学学诊断技断技术包括包括•细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴组织穿刺穿刺•组织学：骨髓活学：骨髓活检、淋巴、淋巴组织活活检￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿ 骨髓活检和骨髓/血涂片•骨髓涂片细胞细微结构清楚评估红系、粒系增生情况及幼稚细胞比例具有优势•骨髓纤维化、细胞致密可干抽•可做组织化学染色（如铁染）•对缺铁性贫血、慢性疾病引起的贫血、巨幼细胞性贫血、和急性白血病的诊断尤其有帮助•骨髓活检显示骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系，对巨核细胞的评估具有优势•不存在干抽和骨髓稀释•可做免疫组织化学染色•对再生障碍性贫血、低增生性白血病、淋巴瘤、转移癌、骨髓增生性肿瘤的诊断具有重要价值•血凝块：废物利用、骨髓活检的补充•注明病史骨髓涂片看骨髓涂片看细胞、骨髓活胞、骨髓活检看看结构，构，相互补充相互验证不能相互替代不能相互替代骨髓/血涂片骨髓活检1.骨髓活检+3项特染2.骨髓涂片+组织化学染色（3）3.免疫组织化学染色4-10项4.血块骨髓活骨髓活检可根据个性化病理可根据个性化病理诊断需要加做免疫断需要加做免疫组织化学染色！化学染色！免疫免疫组化化长度度 ≥ ≥ 1.5cm1.5cm达达标（（≥≥1cm1cm尚可）尚可）长度度 ≤ ≤ 1cm1cm不达不达标长度度 ≤ ≤ 0.5cm0.5cm可能存在可能存在诊断不全面断不全面（不包括皮肤、肌肉、（不包括皮肤、肌肉、软骨、血骨、血块等）等）附附2 2张合格的骨髓涂片（晾干后再包装）合格的骨髓涂片（晾干后再包装）血血块分开固定（收分开固定（收费按小按小标本病理收本病理收费））•注意：取材部位是否有病灶￿￿￿￿￿￿￿￿￿保存液使用福尔马林固定骨髓活骨髓活检标本本长度要求度要求取材的限制•骨髓增生不均匀(与血象不符)•取材过少•取材表浅•组织挤压•活活检增生低下增生低下,涂片增生活涂片增生活跃 骨髓增生不均匀 取材较少,表浅•活活检增生活增生活跃,涂片增生低下涂片增生低下 骨髓增生不均匀 涂片稀释骨髓活骨髓活检与骨髓涂片与骨髓涂片细胞增生不一致胞增生不一致流式流式细胞胞术 流式流式细胞免疫分型的作用胞免疫分型的作用•确定系来源确定系来源–原理：不同系有特定的抗原表达–髓系/B系/T/NK系/组织细胞和树突状细胞•确定确定细胞分化胞分化阶段段–不同发育阶段细胞，其抗原表达不同•预后判断后判断–有些抗原表达和淋巴瘤/白血病预后相关•治治疗方法方法选择-治治疗靶向靶向•疗效判断、复效判断、复发监测 M0 CD34,CD33,CD13 M1 MPO,CD34,CD33,CD13, HLA-DR M2 MPO,CD34,CD15,CD13, HLA-DR M3 MPO, CD33,CD13、CD9(HLA-DR、CD11b常阴性) M4 MPO,CD33,CD15,CD14,CD13 M5 CD68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36，CD64 M6 CD33,CD235a,CD71 M7 CD33,CD41,CD42b,CD61急性髓系白血病免疫表型与急性髓系白血病免疫表型与FABFAB分型相关性分型相关性形态与免疫表型的符合性不足80%，不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型。

FAB基于形态，两者不符以形态为主MRD流式流式细胞胞检测–肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同•跨系表达•抗原表达不同步•抗原表达丢失•抗原表达减弱•其它抗原表达–初始免疫分型结果、白血病相关表型特点–抗体组合越多覆盖率越高、敏感性越高–假阳性、假阴性均存在–随访、动态观察更有意义流式流式检测标本要求本要求•抗凝骨髓/外周血•附2张合格的骨髓涂片（晾干再包装）•完整的病史•MRD需要初次分型资料•组套12、18、24、30、36遗传学学诊断技断技术–细胞遗传学：•核型分析：全基因检测、覆盖面广、敏感性差•FISH：针对性强、敏感性高、周期短、覆盖率低–分子遗传学：•融合基因（RT-PCR\Q-PCR)：针对性强、敏感性高•基因突变（测序、PCR）：覆盖面较大、敏感性较低•染色体异常 包括染色体的结构和数量异常 根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行诊断和分类 细胞胞遗传学学GG带带R R带带C C带带急性白血病染色体急性白血病染色体检测的的临床意床意义•染色体畸变可以作为急性白血病缓解和复发重要参考，最初治疗后异常核型可以消失提示CR，之后重新出现提示白血病复发，有新的核型出现，表明有进展￿•可以作为标志来验证骨髓移植成功与否￿•最初诊断的核型是急性白血病预后最有价值指标预后等级核型类型AMLALL好t(8;21)、￿t(15;17)、inv(16)t(12;21)、染色体数目>50条的超二倍体、dic(9;12)(p11;p12)中正常、+8、+21、+22、11q23异常、del(9q)、del(7q)正常、47-50的超二倍体、t(11;14)差-5、del(5q)、-7、3q异常、复杂异常亚二倍体、近单倍体、t(9;22)、t(4;11)、t(1;19)、t(8;14)急性白血病核型的急性白血病核型的预后分后分级染色体染色体检测常常见问题•标本取材量不足：检测最低白细胞数为10的6次方个细胞•培养后无分裂相或分裂相少于15个：标本白细胞量低，患者正在进行化疗•结果临床不符：分子检测阳性而染色体阴性（染色体分辨率低）•融合基因融合基因BCR/ABL(P210)-CML/ALLBCR/ABL(P230)-CMLBCR/ABL￿(P190)-ALLPML/RARa-M3AML/ETO-M2CBFβ/MYH11X-M4EOMLL重排-M5FLP1L1-PDGFRα-嗜酸细胞增多症•基因突基因突变JAK-2 V617F /539-543突变MPL 外显子10突变分子分子遗传学学-血液病血液病类型确型确诊的分子的分子标志志融合基因融合基因筛查•适用患者￿￿￿￿￿本筛查项目主要用于筛查ALL、AML、CML、AMMOL、CMML、MDS等血液病病种可能出现的31种融合基因或癌基因，及其融合基因的110余种剪切变异情况。

适合无法确定融合基因类别的初初诊患者患者，便于医生对血液病患者进行分子标志物的确定，并进行后续微小残留病灶的监控￿￿￿￿￿￿本项目建议配合染色体核型分析一起检测，以免由于染色体数目异常或携带少见融合基因而造成漏诊￿￿￿￿￿苏州大学附属第一医院州大学附属第一医院对于初于初诊ALL,AML患者都建患者都建议做此做此项目目不同疾病不同疾病筛查项目目•ALL融合基因筛查（18种）•AML融合基因筛查（23种）•APL融合基因筛查￿￿￿￿￿￿￿￿￿继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及RARα的变异性染色体易位：分别产生PLZF-RARα，NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融合基因￿￿￿￿￿￿￿￿临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解•MLL融合基因筛查JAK2 基因突基因突变•已列入WHO2008 MPNs的诊断标准•V617F见于90%以上的PV，约50%的ET、PMF•在PV中，少部分患者为JAK2 Exon12或其它突变•建议JAK2基因突变筛查检测以下几种–V617F; K539L; N542-E543del; E543-D544delMPL基因突基因突变检测•MPL和MPN MPN中以JAK2 V617F最为常见，PV、ET、PMF中的突变频率分别为96%、55%、65%。

MPL突变主要见于ET和PMF，频率分别为2-5%和5-10% MPL可用于JAK V617F阴性的ET和PMF患者的诊断检测目的目的用于JAK2 V617F阴性的ET和PMF患者的诊断 临床考虑ET或PMF的患者可以组合检测 融合基因融合基因BCR-ABL P210JAK2 V617F基因突基因突变MPL基因突基因突变基因阳性率临床意义预后与其他遗传异常相关性KIT5%预后因素差t(8;21)inv(16)/t(16;16)FLT320-40%预后因素差----NPM130%（核型正常）对疾病进行临时性的定义良好 （如果没有FLT3突变）M4, M5CD34 -CEBPA10%对疾病进行临时性的定义良好M1，M2CD7+WHO 2008 新界定的突新界定的突变AML预后基因突变6项•￿￿￿￿￿￿￿CEBPA基因TAD1区突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿CEBPA基因TAD2区突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿CEBPA基因bZIP区突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿C-kit17号外显子￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿FLT3-ITD基因突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿NPM1基因突变检测报告时间：12个工作日价格：1800元AML预后基因突变9项￿￿￿￿￿￿￿￿CEBPA基因TAD1区突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿CEBPA基因TAD2区突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿CEBPA基因bZIP区突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿C-kit（8号外显子和17号外显子）￿￿￿￿￿￿￿￿￿FLT3-ITD基因突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿FLT3基因592位点突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿FLT3基因835位点突变检测￿￿￿￿￿￿￿￿￿NPM1基因突变检测￿报告时间：12个工作日价格：2700元￿￿￿￿TCR和和IgH重排重排项目目•有5-10%的患者无法通过常规方法辨别其淋巴系统的增生是恶性增生还是反应性增生。

￿•正常淋巴细胞在成熟过程中重排是多克隆性的，但恶性肿瘤（＞98%）表现为单克隆性Ig和/或TCR基因重排•适用患者及适应症：疑似淋巴瘤患者的良恶性鉴别诊断淋系白血病患者的鉴别诊断及微小残留跟踪检测￿•目标科室：血液科、肿瘤科、病理科现有有检测方法及相关技方法及相关技术•PCR结合毛细管电泳技术（Genescan）：￿￿￿￿￿￿分辨率高，不易产生假阳性或假阴性•PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术￿ABL激激酶区突区突变•伊马替尼的长期服用导致部分患者，特别是CML 急变期（AP-CML）的患者，发生伊马替尼的耐药，其耐药发生率在20-30%耐药主要由ABL激酶区突变引起，可导致药物疗效下降或失效•适用患者：伊马替尼，尼洛替尼及达沙替尼治疗BCR-ABL阳性CML、ALL患者，建议定期检测，尽早发现耐药•检测范围：BCR-ABL融合基因ABL激酶区52个位点ABL激酶区突变与TKI耐药的关系Sara Redaelli, et. al, JCO, 2009,VOL27(3)469-471分子分子检测常常见问题•标本取材量不足：检测最低白细胞数为10的6次方个细胞•检测内参偏低：目前原因未知•结果临床不符：分子检测覆盖范围问题，其他情况一般假阴性较少MICM整合整合报告告染色体染色体检查的分析前影响因素的分析前影响因素•标本要求：肝素抗凝骨髓，最少标本量为2ml。

需要用公司统一配送的专用肝素钠抗凝管抗凝剂量太多影响培养效果•标本需要当天送检，24小时内到达实验室标本存放于18-25℃常温即可，温度不可高于25℃，不要低于16℃温度过高或过低都会影响细胞存活•药物影响及病情影响：恶性血液病细胞，特别是用药后的细胞存活能力较正常细胞差，不易培养流式流式检查的分析前影响因素的分析前影响因素•标本要求：EDTA抗凝骨髓，最少标本量为2ml•标本需要当天送检，48小时内到达实验室标本存放于18-25℃常温即可，温度不可高于25℃，不要低于16℃￿温度过高或过低都会导致细胞表面抗原脱落，影响结果•药物影响及病情影响：抗原表达谱改变流式流式细胞胞检测注意事注意事项：：•标本要求：EDTA抗凝骨髓/外周血2 ml，避免溶血和凝血，18-25℃常温保存尽快送检，切忌冷冻；•药物影响及病情影响：抗原表达谱改变分子生物学分子生物学检测分析前影响因素分析前影响因素•标本要求：EDTA抗凝骨髓，每个检测项目最少标本量为2 ml，同时检测多个项目需要5-6 ml￿￿￿取骨髓前，吸取少量低浓度肝素，将针头和注射器壁润湿，然后将多余肝素打出针管，再抽取骨髓肝素过多会影响PCR检测。

能不用肝素尽量不用，要用也尽可能少用•标本需要当天送检，48小时内到达实验室￿48小时内到达实验室标本存放于18-25℃常温即可，温度不可高于25℃，不要低于16℃￿温度过高或过低都会造成溶血，影响遗传物质的含量血液病质量体系建设•与UCLA（加利福利亚大学）签订病理合作协议，建立了远程病理会诊平台，对疑难病例进行会诊研讨和科研.实验室建室建设——海外海外专家家￿￿￿￿￿￿￿艾迪康血液艾迪康血液实验室室拥有有UCLA美国多位美国多位专科病理医生科病理医生为顾问同同时与与UCLA建立建立远程病理会程病理会诊平台，平台，进行疑行疑难病理会病理会诊吴吴亿慧慧￿￿医学博士医学博士美国病理医生美国病理医生刘正智刘正智￿￿医学博士、理医学博士、理学博士学博士伊利伊利诺伊大学厄巴伊大学厄巴纳-尚佩恩分校医学院尚佩恩分校医学院临床床副教授，主任病理医副教授，主任病理医师查宏斌宏斌￿￿医学博士医学博士南加利福尼南加利福尼亚永久医永久医疗集集团洛杉洛杉矶医医疗中心血中心血液病理液病理专科科执业医医师。