仪器分析实习指导38733.doc

第五章 现代食品安全检测技术第一节 高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素一、实验目的掌握高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素的原理熟悉高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素的实验措施理解高效液相色谱仪的基本构造与使用措施二、实验原理（一）四环素是一种广谱抗菌素，可用于治疗和避免某些动物性疾病，但如果长期使用，将导致四环素类药物在动物类组织中的残留残留在动物类组织中的四环素类药物会影响食用者的健康四环素类药物的毒性反映重要体现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等，还会导致过敏反映、二重感染、致畸胎作用因此应严格控制其在食品中的残留量二）用酸性的Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲溶液将蜂蜜中蛋白质沉淀 ,同步将四环素提取出来，以草酸与乙腈为流动相，C18柱作为色谱柱，反相分离，紫外检测器检测，在四环素的原则曲线的线性范畴内，根据其测得的峰面积与其含量间的线性关系进行定量分析三、仪器和试剂（一）仪器 1. 高效液相色谱仪 2．紫外检测器 3．涡旋混合器 4．离心机 5．天平 （二）试剂 1．甲醇 2．乙腈 3．乙酸乙酯 4．磷酸二氢钠 5．盐酸 6．柠檬酸 7．乙二胺四乙酸二钠 8．草酸四、操作环节1．提取 （1）称取5g试样，置于50mL离心管中，加入30mL0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液,迅速混合1min, 以3500r/min离心10min，上清液倒入另一离心管中。

2）将上清液通过固相萃取柱，用2mLNa2EDTA-Mcllvaine溶液冲洗，再用20mL水洗，弃去所有流出液，减压抽干10min，用4mL流动相洗脱，定容至4mL，供液相色谱-紫外检测器测定 2．原则溶液的配制（1）称取四环素10mg，用甲醇溶解，并转移至100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得四环素储藏液（0.1mg/mL）精确移取该溶液1mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度,得0.01 mg/mL精确移取该溶液0，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得四环素原则溶液的浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.40，0.80mg/mL 3．测定（1）色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，150mm×4.6mm, 5mm；流动相：0.01mol/L草酸溶液（pH=2.5）-乙腈（80：20）；流速：1mL/min; 柱温：室温；紫外检测器：检测波长：355nm2）将上述已制备好的不同浓度的四环素原则系列溶液一次进样20mL，根据四环素的峰面积定量以原则系列溶液的浓度为横坐标，其相应的峰面积为纵坐标，绘制原则曲线，并计算回归方程。

3）样品的测定：取已解决好的样品溶液20mL进样分析，根据峰面积带入回归方程中计算五、成果计算按下式可计算出蜂蜜中四环素的含量X=C×V/m式中：X为试样中四环素的含量，单位为mg/g; C为从原则曲线计算得到的被测组分溶液浓度，单位为mg/mL；V为试样溶液定容体积，单位为mL；m为试样溶液所代表的试样质量，单位为g六、注意事项（一）流动相使用前必须通过脱气如果流动相中具有气体，在较高的柱压下会产气愤泡，使流动相流动受阻，对分离样品产生不利影响二）固相萃取柱使用前应用5mL甲醇和10mL水活化陈凌云）第二节 液相色谱-串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考一、实验目的（一）基本熟悉现代食品安全检测技术中高效液相色谱-串联质谱联用技术的测定措施和特点；（二）理解液质联用技术的基本原理以及在食品安全检测中的重要性二、实验原理氟苯尼考又名氟洛芬、氟甲砜霉素，分子式为C12H14Cl2FNO4S；分子量为358.2127；构造式为氟苯尼考是一种兽用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病，特别对呼吸系统感染和肠道感染疗效明显样品中的氟苯尼考在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液经旋转蒸发挥干，残渣以水溶解，经正己烷液-液萃取脱脂。

液相色谱-串联质谱仪，以氘代氯霉素（d5-氯霉素）为内标，MRM离子对方式检测，内标法定量三、试剂和仪器甲醇（HPLC）、乙酸乙酯（AR）、正己烷（AR）、氨水（AR，25%～28%）、无水硫酸钠（AR）、氟苯尼考和氘代氯霉素（d5-氯霉素）原则物质（纯度>99%）、超纯水液相色谱-串联质谱仪（API 4000 Qtrap），配电喷雾电离离子源（ESI）；分析天平，感量0.01mg和0.001g；离心机，≥4000r/min；小型台式离心机，≥13000r/min；组织捣碎机；匀浆机；减压旋转蒸发仪；涡旋振荡器；聚丙烯离心管：带盖，50mL，1.5mL；鸡心瓶：25mL；具塞比色管等四、操作环节（一）原则溶液配制1．100μg/mL原则储藏液的配制：称取适量氟苯尼考原则物质，用甲醇配成100μg/mL的原则储藏液，于-18℃冰箱保存备用2.1μg/mL原则储藏液的配制：精确吸取1.00mL 100μg/mL原则储藏液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃冰箱保存备用3.内标原则溶液：氘代氯霉素（d5-氯霉素），100μg/mL，溶剂为乙腈，氘化度≥98%4.1μg/mL内标原则储藏液：精确吸取1.00mL内标原则溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容至刻度，于-18℃冰箱保存备用。

5.20ng/mL内标原则中间液：精确吸取1.00mL内标原则储藏液于50mL容量瓶中，以超纯水稀释至刻度，于4℃冰箱保存备用6.原则工作溶液的配制：分别精确吸取一定量的原则储藏液和内标原则中间液，以空白基质溶液配成10、50、100、200、500ng/mL，含内标10ng/mL的原则工作溶液二）样品的制备1.标记：从所取样品中，取出有代表性的可食部分约500g，用组织捣碎机充足捣碎均匀，装入干净容器，密封，并标明标记2.提取：称取5g充足捣碎均匀的试样，精确至0.001g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入内标原则中间液75.0μL，加入25mL乙酸乙酯，0.75mL氨水，3g无水硫酸钠，匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至50mL比色管中另取一50mL离心管，加入20mL乙酸乙酯，0.60mL氨水，洗涤匀浆刀10s，洗涤液转移至第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，涡旋振荡提取1min，超声波振荡提取5min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，乙酸乙酯定容至50.0mL摇匀后移取10.0mL乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶，45℃减压旋转浓缩至干。

3.净化：鸡心瓶中的残渣用2.00mL水溶解，涡旋振荡混匀，超声5min，加入3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，移取部分下层的水相至1.5mL的聚丙烯离心管中，13000r/min离心5min，0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定4.空白基质溶液的制备：称取5g空白样本，精确至0.001g，除不加入内标原则中间液，其他按照样品制备、净化的环节进行三）液相色谱条件1.色谱条件色谱柱：安捷伦 Zorbax XDB C-18，5μm，150mm×2.1mm；柱温：40℃；流动相：甲醇-水（4/1）；流速：0.40mL/min；进样量：10μL2.质谱条件离子源：电喷雾电离离子源（ESI）；扫描方式：负离子；检测方式：多反映选择离子检测（MRM）；质谱条件的优化：以1μg/mL的氟苯尼考和氘代氯霉素内标溶液，针泵直接进样，流速5μL/min，分别进行MS1、MS2的优化，拟定相应质谱参数，选择合适的检测离子对电喷雾电压(IS)：-4200V；辅助气温度（TEM）：600℃，其他参数见下表5-2-1：表5-2-1氟苯尼考、氘代氯霉素（d5-氯霉素）质谱参数名 称定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)采集时间（ms）去簇电压DP（V）碰撞能量CE（V）氟苯尼考356.0/336.0356.0/336.0200-75-15356.0/185.0-25氘代氯霉素326.0/157.0326.0/157.0-55-26五、成果计算以内标法定量，在优化的最佳条件下，对基质原则工作溶液进样，以原则溶液中被测组分的峰面积与氘代氯霉素峰面积的比值为纵坐标，原则溶液中被测组分的浓度（或被测组分浓度与氘代氯霉素浓度的比值）为横坐标绘制原则工作曲线，用原则工作曲线对样品进行定量，得提取液的含量C。

按下式计算出蔬菜中被测组分的含量式中：X——试样中被测组分残留量，单位为微克每公斤（μg/kg）；C——从原则工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——样品溶液最后的定容体积，单位为毫升（mL）；m——称取试样的质量，单位为克（g）六、注意事项（一）样品采集要均匀、具有代表性；（二）试样要捣碎、匀浆彻底；（三）流动相要过滤、脱气，并现时配制；（四）避免样品污染；（五）色谱柱要充足平衡马安德）第三节 电感耦合等离子体质谱法检测茶叶中铅、砷及镉含量一、实验目的（一） 掌握电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定元素含量的原理、分析过程中的各项干扰状况及其消除措施、基本分析环节（二） 熟悉电感耦合等离子体质谱仪的基本构造及操作（三） 掌握元素（总量）分析的样品前解决措施二、实验原理ICP-MS由进样系统、离子源和质谱仪三个重要部分构成样品溶液通过雾化由载气送入ICP炬焰中，通过蒸发、解离、原子化、电离等过程，转化为带正电荷的正离子，经离子采集系统进入质谱仪，质谱仪根据质荷比进行分离对于一定的质荷比，质谱积分面积与进入质谱仪中的离子数成正比即样品的浓度与质谱的积分面积成正比，通过测量质谱的峰面积来测定样品中元素的浓度。

三、试剂和仪器（一）试剂硝酸（优级纯）H2O2（优级纯）纯水：电阻率不小于18.0MΩ·cm铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）混合原则使用溶液：10 mg/L锗（Ge）、铟（In）、铋（Bi）内标溶液：100 μg/L（二）仪器Thermo fisher XSeriesII电感耦合等离子体质谱仪Millipore超纯水制备仪美国CEM Mars微波消解仪及配套消解管和架子精确控温电热消解器千分之一天平100 mL、1 mL、5 mL可调移液器各一支，以及相应吸头若干100 mL容量瓶11个、1000 mL烧杯1个、10 mL量筒1个、1000 mL量筒1个四、操作环节(一) 仪器开机预热（如下环节基于实验教师将仪器预先调节到Vacuum ready状态下进行）检查Ar气压力与否在0.6~0.7MPa范畴内，排风与否正常，电源与否稳定；打开计算机，启动Windows，打开循环冷却水的电源；双击“Plasma Lab” 图标，进入操作软件主窗口检查蠕动泵、ICP炬管、雾化室，关闭ICP等离子体发生器窗门；点击on点火；待仪器点火后，预热；（二） 原则溶液系列的制备1. 于1000 mL烧杯中加入594 mL去离子水，再定量吸取6 mL浓硝酸加入烧杯中，搅拌、冷却，配制成（1+99）的硝酸溶液；2. 于5个100 mL的容量瓶中分别加入0、50 mL、200 mL、1 mL和2.5 mL的铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）。