毕赤酵母电转化方案.doc

毕赤酵母电转化方案一、培养基BMMY培养基：酵母粉10g,蛋白胨20g,溶于700mL去离子水，湿热灭菌3Omin,冷却后加入100mL1MpH6.0磷酸钾缓冲液，100mLlOxYNB,2mL500xB,100mL10xM,4°C保存BMGY培养基：酵母粉lOg,蛋白胨20g,溶于700mL去离子水，湿热灭菌20min,冷却后加入100mL1M,pH6.0,磷酸钾缓冲液，100mL1OxYNB,2mL500xB,100mL10xGY,4°C保存YPD培养基：酵母粉10g,蛋白胨20g,溶于900mL去离子水，湿热灭菌3Omin,冷却后加入100mL1OxD,4°C保存MD培养基：800mL灭菌水中加入100mLlOxYNB,2mL500xB,100mL1OxD,4C保存1M,pH6.0的磷酸钾缓冲液：132mL1MKHPO,868mL1MKHPO,pH6.0,2424湿热灭菌，4°C保存10xYNB：YNB134g（含硫酸铵）溶于1000mL去离子水，过滤除菌，4°C保存500xB：20mgBiotin溶于100mL去离子水，过滤除菌，4°C保存10xM：5mL甲醇与95mL去离子水混合，过滤除菌，4°C保存。

10xGY：100mL甘油与900mL去离子水混合，湿热灭菌，4°C保存10xD：100g葡萄糖溶于1OOOmL去离子水，过滤除菌，4°C保存1M山梨醇：18.2gD-山梨醇溶于10OmL去离子水，过滤除菌，4°C保存二、转化步骤1•接种毕赤酵母的单菌落到含有5mLYPD液体培养基的三角瓶中，30°C过夜培养2. 转接含有50mLYPD液体培养基的大三角瓶，接种量1%,30C培养过夜，直到OD=1.3〜1.5；6003. 1500g,4°C条件下离心培养液5min,再用50mL冰浴的双蒸水重悬细胞；4•重复第三步的离心操作，然后用25mL冰浴的双蒸水重悬细胞；5•重复第三步的离心操作，然后用2mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞；6. 重复第三步的离心操作，然后用lOOpL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞，使菌悬液体积大约为150pL；7. 将80yL处理好的感受态细胞和5〜20yg经过线性化了的DNA（溶解在双蒸水中，体积为5〜10吐）加入一个1.5mL预冷离心管中，混匀然后把混合液转移入预先冰浴的转化杯中（0.2cm型）；8•冰浴装有转化混合液的转化杯5min；9. 按照如下参数设置电转化仪，并启动电脉冲：CuvetteGap0.2cmVoltage1.5kVFieldStrength7.5kV/cmCapacitor25pFResistor（PulseController）400TimeConstantapproximately8.0msec10. 脉冲后立即往转化杯中加入1mL冰浴的1M的山梨醇溶液，然后把转化液转入一个新的1.5mL离心管中；11. 30°C静置培养1〜2h；12. 吸取GS115的转化液50〜200pL涂布MD平板；13. 30C培养，直到转化子出现。

三、外源蛋白的诱导表达液体培养基中，0，液体培养基中，C,9液体培养基重悬细胞至，振荡培.，0甲醇终浓度1.接种筛选出来的毕赤酵母重组子于振荡培养过夜；2取|J过夜培养物转接于养至〜对数生长期，大约31离心，弃上清，用为％;4置于三角瓶中，用层灭菌纱布封口，C，，振荡培养；5诱导后，培养液，离心，上清液和菌体分别于C冻存。