药学细胞实验笔记(概念 实验 注意 分析 计算).doc

IC50 是指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应、抗原抗体反应等 在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡 50%，该浓度称为 50%抑制浓度， 即凋亡细胞与全部细胞数之比等于 50%时所对应的浓度，IC50 值可以用来衡量药物诱导凋亡的能 力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度 半抑制浓度（或称半抑制率） ，即 IC50在间接竞争 ELISA 标准曲线中是一个非常重要的数据， 标准曲线是一个 S 型曲线 ICELISA 中，不添加抑制物质的对照孔的 OD 值为 B0, 添加了抑制物质的孔的 OD 值为 B B/B0% 就叫做结合率， 在结合率为 50%时所对应的抑制物质的浓度就叫做 IC50 一般 IC50 的数值越小，说明你的抗体的特异性能越强！ 最小检测限为试剂盒标准曲线的最小的浓度，小于最小浓度或大于最大浓度，即不在曲线范围内的 都不准确，大于最大浓度可以稀释后测 IC50 为 50%抑制浓度即 B/B0=50%时所对应的浓度，半数抑制是用来衡量抗体灵敏度的半数抑制 越低，说明抗体的灵敏度越高 检测下限一般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到的最小的值。

定量限为实际检测时可以定量的最低的值 最大检测限就是实际操作中抑制率达到 100%时的药物浓度 检测下限（LOD）对应的 OD 值：OD(LOD) =B0－3SD 定量限（LOQ）对应的 OD 值：OD（LOQ）= B0－10SD 酶活力单位（U，active unit） 酶活力的度量单位1961 年国际酶学会议规定：1 个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为 最适条件）下，在 1 分钟内能转化 1 微摩尔底物的酶量，或是转化底物中 1 微摩尔的有关基团的 酶量 酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示 其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1 分钟内转化 1 微摩尔底物，或者底物中 1 微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又 称 U） 另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是 Kat，规定为：在最适条件下，1 秒钟能使 1 摩尔底转 化的酶量 Kat 和 U 的换算关系：1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat 酶的比活力（specific activity）：是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力是用来度 量酶纯度的指标。

是生产和酶学研究中经常使用的基本数据 酶的转化数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数生产中并不常 用 Michaelis-Menten 曲线(X 轴底物浓度 Y 轴速度)，处理后得到 Km 和 Kcat 一、原理 噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶 解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量 二、试剂材料准备与实验仪器 1）对数生长期细胞 2）受试因素（药物）3）MTT：以 PBS 配制成 5mg./ml，抽虑除菌，保存在 4˚C4）DMSO（二甲基亚砜） 5）96 孔板 6）酶联免疫检测仪 7）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞） 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整 2）置 37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁 3）加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml 的药物，时间依据实验需 要，一般 3 天。

4）小心吸去上清，PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清 5）每孔加入 180ul 新鲜 RPMI1640 培养液，再加入 20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT） ， 继续培养 4 h 6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min） ，小心吸去孔内培养液 7）每孔加入 150 ul 二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS 代替） ，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值 8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） ，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、 培养液、MTT、二甲基亚砜） ，每组设定 3 复孔 三、结果统计学处理 所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p<0.05 时为相差显著，p<0.01 时为相差非常显著可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式 求 IC50或计算抑制率 四、注意事项与常见问题 1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜对照孔和加药 孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不 同浓度的药物。

2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太 少观察不到差异 3）贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为 20ul/ 孔 4）如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 ml，MTT 按照 10%的比例加入 5）MTT 一般 4 度保存两周，注意避光保存，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反 复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下 6）对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm 有最大吸收值；而对于 SDS 和酸化异丙醇，则选 用 570nm，并且建议以 655nm 作为参考波长 7）96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较 快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同对于这种现象，要保证培养箱中的 湿度，减少开关培养箱的次数和时间 8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个 就要再混匀一下 9）没有去掉上清直接加 DMSO，沉淀会很难溶解。

加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液里的紫 色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心 96 孔板， 2000r，5 分钟，然后吸掉上清加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测 10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔 11）除置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可； 或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶 12）关于如何计算 IC50 方法有多种(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)(2)Bliss 法:自己查阅书籍(3) IC50 计算软件，见下面附件 （4）自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50，关于 LD50 的方法与此相似！（5）求 IC50 或 EC50： 13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%. MTT 试验的一些细节问题(一)细胞 1.选择适当的细胞接种浓度一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞 但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行 MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、 倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保 证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系否则细胞 数太多敏感性降低，太少观察不到差异 2.药物浓度的设定一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛根据自己初筛 的结果缩小浓度和时间范围再细筛切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度 和时间 3.时间点的设定在不同时间点的测定 OD 值，输入 excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变 化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时 间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显） 4.培养时间200ul 的培养液对于 10 的 4～5 次方的增殖期细胞来说，很难维持 68h，如果营养 不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止，影响结果，我们是在 48h 换液的. 5.MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数做 MTT 时，尽量无菌操作，因 为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高 6.理论未必都是对的要根据自己的实际情况调整 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜对照孔和加药孔 都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同 浓度的药物。

8.避免血清干扰用含 15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值 由于试验本底增加，会试验敏感性因此，一般选小于 10％胎牛血清的培养液进行在呈色后， 尽量吸净培养孔内残余培养液 (2)实验步骤 贴壁细胞 1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000 孔， （边缘孔用无菌 PBS 填充） 2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴 壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般 5-7 个 梯度,每孔 100ul,设 3-5 个复孔.建议设 5 个，否则难以反应真实情况 3.5%CO2，37℃孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察 4.每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT） ，继续培养 4h若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液 5.终止培养，小心吸去孔内培养液 6.每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测 仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） ，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养 液、MTT、二甲基亚砜）. 悬浮细胞： 1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 1×106/ml，按次序将①补足的 1640（无血清）培养基 40ul ；②加 Actinomycin D（有毒性）10ul 用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度， 1:10-1:20)；③需检测物 10ul；④细胞悬液 50ul（即 5×104cell/孔） ，共 100ul 加入到 96 孔 板（边缘孔用无菌水填充） 每板设对照（加 100?(储存液 100 1640） 2.置 37℃，5%CO2 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察3.每孔加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT） ，继续培养 4 h （悬浮细胞推荐使用 WST- 1，培养 4 h 后可跳过步骤 4） ，直接酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值）4.离心（1000 转 x10min） ，小心吸掉上清，每孔加入 100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值 5.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） ，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养 液、MTT、二甲基亚砜） ，每组设定 3 复孔 MTT 的配制MTT 一般最好现用现配，过滤后 4oC 避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml 。