人工虫草对STZ诱导糖尿病大鼠心肌NFκB和TGFβ1表达影响的研究.pdf

分类号：R 5 8 7 ．1密级：学位类别：科学学位学校代码：学号：学科门类：1OO622 0 1 0 6 0 2 3 4 3医学 天蚌酱针^ 峥 T l A N J l NM E O I C A LU N I V E R S I T Y硕士学位论文M L A S T E R ’SD I S S E R T A T I O N论文题目：人工虫草对S T Z 诱导糖尿病大鼠心肌N F ．K B 和T G F ．B l 表达影响的研究TITL EE f f e c t so fa r t i f i c i a lc o r d y c e p ss i n e n s i so nt h ee x p r e s s i o n so fN F - K Ba n dT G F - f l li nt h ec a r d i a cm u s c l eo fS T Zi n d u c e dd i a b e t i cr a t s一级学科：临床医学二级学科：内科学内分泌与代谢病论文作者：谷优优指导教师：高桦天津医科大学研究生院二一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意学位论文作者签名：蝉嗍圳够月彳日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库保密口，在——年解密后适用本授权书本论文属于 不保密函 请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：日期：7 叫’年y 月叫日 日期：例弓年朔讲目天津医科大学硕士学位论文中文摘要背景：糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，D M ) 的慢性并发症可累及全身多器官和组织，糖尿病心肌病( d i a b e t i cc a r d i o m y o p a t h y , D C ) 是一种与D M 密切相关的特殊类型心肌病，主要病理特征为心肌细胞肥大、肌纤维溶解、破坏、玻璃样变性、间质纤维化，并可见炎细胞浸润，其发病机制尚不十分清楚。

近年来研究认为免疫反应和低度炎症过程与D M 及D C 关系密切，炎症因子核因子．r , B ( N F ．迎) 、转化生长因子．1 3 1 ( T G F ．1 3 1 ) 的异常表达可能参与了D C 的发生既往研究表明，链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠存在多器官免疫损伤，且免疫抑制剂环孢菌素治疗可以减轻器官的免疫损伤环孢菌素具有多种毒副作用，如肝肾毒性、导致血压升高等，因此应积极寻找有效且副作用更小的治疗方案人工发酵虫草菌丝体干粉( C o r d y c e p ss i n e n s i sc u l t i v a t e db ya r t f i c i a lf e r m e n t a t i o n ，C S ) 是经人工发酵培育而得的天然虫草替代品，与天然虫草具有同等有效成分研究表明，虫草类及其菌丝培养物( 拟青霉) 对机体免疫功能具有较强的抑制作用目的：本研究旨在通过一次性尾静脉注射链脲佐菌素( S t r e p t o z o t o c i n ，S T Z ) 的方法建立1 型糖尿病大鼠模型，应用人工发酵虫草菌丝体干粉( C S ) 进行干预，观察C S 对糖尿病大鼠心肌N F —r ．B 和T G F ．1 3 1 表达的影响。

方法：9 0 只雄性8 周龄S D 大鼠，随机抽取1 0 只作为正常对照组( C O N 组) ，其余作为实验组实验组大鼠一次性尾静脉注射大剂量( 4 5 m g ／k g ) 链脲佐菌素所有成模大鼠根据血糖水平分层，随机分为糖尿病组( D M 组) ，C S 小剂量组( L组，0 ．6 9 ／k g ．d ) ，C S 中剂量组( M 组，2 ．5 9 ／k g ．d ) ，C S 大剂量组( H 组，5 9 ／k g ．d ) 和吡咯列酮组( P I O 组，4 m g ／k g ．d ) 药物干预8 周处死大鼠，留取血、尿标本分别检测肝肾功能、血糖、血脂和尿微量白蛋白光镜下观察各组大鼠心肌病理组织学改变，免疫组织化学法、R T - P C R 法检测心肌N F ．r ．B 、T G F ．1 3 1 蛋白和m R N A的表达水平所得数据采用单因素方差分析进行统计学分析结果：1 ．成功建立了S T Z 诱导的糖尿病大鼠模型2 ．各实验组大鼠随机血糖值均显著高于正常对照组( P O ．0 5 ) 3 ．光镜下，糖尿病组大鼠可见心肌细胞肥大、肌纤维溶解、破坏、肌横纹消失及炎细胞浸润；各C S 治疗组大鼠心肌损伤有不同程度减轻。

4 ．糖尿病组大鼠心肌N F —r , B 、T G F —B 1 蛋白和m R N A表达均明显上调( P 2 6 m m o l ／L ) 的大鼠皮下注射适量( 0 ．5 ．1 I U ) 长效胰岛素，使随机血糖维持在1 6 ．7 ．2 6 ．0 m m o l ／L 之间各组大鼠每周测体重一次分别于第4 、8 周收集大鼠2 4 h 尿标本，标本离心后取上清液．8 0 C 冰箱保存待测尿蛋白于干预后第8 周股动脉放血处死大鼠，将1 0 m l 血标本离心取血清置．8 0 ℃冰箱保存以待测甘油三酯、胆固醇、尿素氮、肌酐和谷丙转氨酶剖胸取出心脏，切取部分心肌以1 0 ％福尔马林溶液固定，用于H E 、M A S S O N 及免疫组化检测；其余心肌组织液氮保存，以备R T - P C R 检测2 ．4 生化指标的测定2 4 小时尿微量白蛋白定量测定采用免疫比浊法；血清胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶、血糖、尿素氮、肌酐采用全自动生化分析仪检测，由天津医科大学总医院生化实验室技术员专人操作2 ．5 组织病理学检测2 ．5 ．1 石蜡标本的制作大鼠部分心肌组织置于l O ％q b 性福尔马林液中固定2 4 小时以上，脱水包埋。

经改刀后置于1 5 ％甲醛中2 4 h 以上，7 0 ％乙醇3 0m i n ，8 0 ％乙醇1h ，9 5 ％乙醇4 5m i n ，1 0 0 ％乙醇1 5m i n ，苯1 0 m i n ，软蜡1 0m i n ，硬蜡3 0m i n ，石蜡包埋石蜡包埋后，5 岬厚连续切片H E 、M a s s o n 染色用载玻片为普通玻片，经酸浸泡过夜，9 5 ％乙醇浸泡3 0 m i n 后擦干后备用免疫组化染色用载玻片仍需用防脱片胶处理后的载玻片所得切片均需6 0 ．7 0 C 温箱烘干后，常温保存备用2 ．5 ．2H E 染色( 1 ) 脱蜡至水：二甲苯I1 5 m i n ，二甲苯I I1 5 m i n ，无水乙醇I5 m i n ，无水乙醇7天津医科大学硕士学位论文人工虫草对S T Z 诱导糖尿病大鼠心肌N F - r ．B 和T G F - B 1 表达影响的研究I I5 m i n ，9 5 ％乙醇5 m i n ，8 0 ％乙醇5 m i n ，蒸馏水清洗7 m i n 2 ) 染色：苏木素5 m i n ，自来水冲洗5 m i n ；盐酸酒精分色约5 s ，自来水充分冲洗1 5 m i n ；液氨水中浸泡5 s 使胞核蓝化，自来水充分冲洗1 5m i n ；伊红染液中染色3 0 s ，自来水充分冲洗1 5m i n ；蒸馏水浸泡。

3 ) 脱水：8 0 ％乙醇5 m i n ，9 5 ％乙醇5 m i n ，无水乙醇I5 m i n ，无水乙醇I I5 m i n ，二甲苯I5 m i n ，二甲苯I I5 m i n 4 ) 封片：中性树胶封片结果分析：细胞核呈蓝色，细胞浆呈淡红色2 ．5 ．3M a s s o n 染色( 1 ) 切片脱蜡至水的过程同H E 染色脱蜡步骤 2 ) 染色：苏木素染色5 m i n ，流水洗涤5 m i n ，蒸馏水浸一下：M a s s o n 复合染色液染色5 m i n ，蒸馏水浸一下；擦干多余水分，1 ％磷钼酸分红5 m i r a2 ％亮绿染色液染色5 m i n ，蒸馏水浸一下；擦干多余水分，用1 ％磷钼酸分绿5 m i n ；进行逆行脱水：9 5 ％酒精迅速蘸一下，无水乙醇5 m i n ，无水乙醇5 m i n ，二甲苯1 0 m i n ，二甲苯1 0 m i n 3 ) 封片：中性树胶封片结果分析：心肌胶原纤维呈绿色改变，心肌纤维呈红色，胞核呈蓝黑色2 ．5 ．4 大鼠心肌N F ．r d 3 、T G F ．B 1 的免疫组织化学表达采用卵白素．生物素复合技术( A v i d i n ．B i o t i n e o m p l e x m e t h o d ，A B C ) ，具体步骤如下：( 1 ) 载玻片应先用防脱片胶处理。

2 ) 石蜡包块切片后，所得切片置6 0 C 恒温烤箱过夜使得切片紧密黏附 3 ) 切片常规脱蜡至水 方法同H E 染色脱蜡步骤)( 4 ) 双蒸水新鲜配置3 ％H 2 0 2 ，室温孵育3 0m i n 以灭活内源性过氧化物酶后用清水冲洗1 5 m i n ，蒸馏水浸一下再用O ．1 MP B S 冲洗3 次，每次5 m i n 5 ) 枸椽酸缓冲液( 0 ．0 1 M ，P H 6 ．0 ) 浸泡切片，用微波炉中高火加热5 分钟，停5 分钟，共3 次，进行抗原修复自然放凉后用P B S 洗3 次，每次5 分钟 6 ) 滴加合适稀释浓度的一抗：N F ．r B 稀释倍数为1 ：1 0 0 ，T G F ．1 3 1 稀释倍数为1 ：5 0 ，均匀完全覆盖组织后，置于冰盒中在40 C 冰箱孵育过夜 7 ) 冰盒自冰箱取出后室温放置3 0 m i n ，0 ．1 MP B S 洗涤3 次，每次5 m i n 8 ) 分别加入P V - 6 0 0 1 免疫组化检测试剂盒，完全覆盖切片，在3 7 ℃温箱中9 呼R天津医科大学硕士学位论文人工虫草对s T z 诱导糖尿病大鼠心肌N F - r 。

B 和T G F ．B 1 表达影响的研究育3 0 分钟室温放置5 m i n 后，0 ．1 MP B S 洗涤3 次，每次5 m i n 9 ) D A B 显色：使用D A B 显色试剂盒取l m l 双蒸水，加试剂中A 、B 、C试剂各1 滴，混匀后滴至切片避光室温显色，显微镜下控制反应时间为7 分钟再用流水冲洗1 5 m i n 1 0 ) H a r r i s 明矾苏木素复染核5 秒，自来水冲洗5 分钟，盐酸酒精分色3 秒钟，自来水冲洗1 5 分钟，蒸馏水浸一下，依次入8 0 ％、9 5 ％、1 0 0 ％、1 0 0 ％乙醇脱水，二甲苯透明，各约5 分钟，后用中性树胶封片，显微镜观察结果分析：镜下棕黄色染色为阳性染色，淡蓝色染色为阴性染色免疫组化用图像采集系统以4 0 x 物镜采集图像，采用I m a g e ．P r o P l u s 6 ．0 对图像中的阳性反应部位进行I O D 值分析每张载片随机采取图像1 0 副，取其平均值作为每张的结果I O D 值越高表明其免疫组化信号越强2 ．6R T - P C R 检测心肌组织中N F ．r ．B 、T G F ．B 1 的表达水平2 ．6 ．1组织总R N A 的提取和鉴定( 1 ) 从液氮中取出大鼠心肌，剪取约l O O m g 组织，立即投入加有l m lT r i z o l 的研磨器中，冰浴中充分匀浆。