红细胞检验的基本方法课件.ppt

铁指标检验的几个概念1.1.血清铁血清铁(serum iron )(serum iron )2.2.血清转铁蛋白血清转铁蛋白(serum transferrin)(serum transferrin)3.3.血清铁蛋白血清铁蛋白(serum ferritin)(serum ferritin)4.4.血清总铁结合力血清总铁结合力(TIBC)(TIBC)5.5.转铁蛋白饱和度转铁蛋白饱和度 一、一、 SI(serum iron)SI(serum iron)的测定的测定1.1.原理原理SF SF PHPH↓+↓+还原剂还原剂 →→FeFe2+2++ +显色剂显色剂→→络合物络合物成年男性成年男性11.611.6～～31.3μmol31.3μmol／／L L 成年女性成年女性9.09.0～～30.4μmol30.4μmol／／L L降低：见于缺铁性贫血（降低：见于缺铁性贫血（IDAIDA）、慢性失血和）、慢性失血和 感染等增高：见于肝疾病、铁粒幼细胞贫血、慢性增高：见于肝疾病、铁粒幼细胞贫血、慢性 溶血和反复输血等溶血和反复输血等。

二、二、 SF(serum ferritin)SF(serum ferritin)的测定的测定（（125125I I标记标记SF+SF+待测血待测血SFSF））+ +定量抗体定量抗体→ → 125125I I复合物复合物1+1+复合物复合物2 2125125I I标记标记SF+SF+定量抗体定量抗体→ → 125125I I复合物复合物3 32 2、参考值：、参考值：成人男性成人男性1515～～200μg200μg／／L L，， 女性女性1212～～150μg150μg／／L ,L ,小儿低于成人；小儿低于成人；3 3、临床评价：、临床评价：①①降低：见于降低：见于IDAIDA早期、失血、慢性贫血等早期、失血、慢性贫血等②②增高：见于肝疾病、血色病、急性感染和恶增高：见于肝疾病、血色病、急性感染和恶 性肿瘤等性肿瘤等 三、三、 TIBCTIBC测定测定1.1.过量铁标准液过量铁标准液+ +血清血清→→SFSF2.SF 2.SF PHPH↓+↓+还原剂还原剂→→FeFe2+2++ +显色剂显色剂→→有色络合物有色络合物TIBCTIBC：男性：男性5050～～77μmol77μmol／／L L 女性女性54 54 ～～77μmol77μmol／／L LUIBCUIBC：：25.125.1～～51.9μmol51.9μmol／／L L① ① 增高：见于增高：见于IDAIDA和红细胞增多症等。

和红细胞增多症等② ② 降低或正常：见于肝疾病、恶性肿瘤、溶降低或正常：见于肝疾病、恶性肿瘤、溶 血性贫血、慢性感染和肾病综合征等血性贫血、慢性感染和肾病综合征等四、铁吸收率测定四、铁吸收率测定当体内缺铁时，铁蛋白的利用加快，肠道对铁吸收也增当体内缺铁时，铁蛋白的利用加快，肠道对铁吸收也增加口服放射性加口服放射性5959FeFe，测定体内，测定体内5959Fe Fe 放射性量比率的放射性量比率的变化，可推算出铁吸收率变化，可推算出铁吸收率正常值正常值:26.0:26.0％～％～35.035.0％％增加：见于增加：见于IDAIDA，可高达，可高达5050％～％～8080％降低：见于肠道吸收不良综合征降低：见于肠道吸收不良综合征正常：见于正常人、再障、巨幼细胞贫血、正常：见于正常人、再障、巨幼细胞贫血、 急性失血等急性失血等五、血清转铁蛋白测定五、血清转铁蛋白测定免疫散射比浊法：利用抗人转铁蛋白血清与免疫散射比浊法：利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物，待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出转铁蛋白含量。

可计算出转铁蛋白含量免疫散射比浊法为免疫散射比浊法为28.628.6～～51.9μmol51.9μmol／／L L增高：见于增高：见于IDAIDA和妊娠降低：常见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿降低：常见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿 瘤、炎症等瘤、炎症等六、血清转铁蛋白受体测定六、血清转铁蛋白受体测定双抗体夹心法双抗体夹心法1.1.血清中转铁蛋白受体血清中转铁蛋白受体+ +抗体抗体2.2.抗原抗体复合物抗原抗体复合物+ +酶抗体；酶抗体；3.3.加入底物和显色剂，其颜色的深浅与转铁蛋白受体的量加入底物和显色剂，其颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比以不同浓度标准品的吸光度值绘制标准曲线，成正比以不同浓度标准品的吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线查出未知标本的转铁蛋白受体通过标准曲线查出未知标本的转铁蛋白受体水平升高：常见于缺铁性贫血和溶血性贫血升高：常见于缺铁性贫血和溶血性贫血降低：见于再障、慢性病贫血、肾功能衰竭等降低：见于再障、慢性病贫血、肾功能衰竭等用于临床观察骨髓增生状况和治疗反应用于临床观察骨髓增生状况和治疗反应小低贫的初步诊断1.HGB（g/L） 男性<120 女性<1102.HCT <0.35 男性<0.40 女性3.RBC （1012/L） 男性<4.0 女性<3.5 4.MCV(fl) <80 fl=10-15L5.MCH (pg)<27 pg=10 –12g6.MCHC <0.32血清铁指标检验的应用 小细胞低色素性贫血的鉴别小细胞低色素性贫血的鉴别 铁铁 总铁结合力总铁结合力 铁饱和度铁饱和度 铁蛋白铁蛋白缺铁贫缺铁贫 减低减低 增高增高 减低减低 减低减低ß地贫地贫 正常正常 正常正常 正常正常 正正/ /高高慢感贫慢感贫 减低减低 正正/ /低低 减低减低 增高增高铁粒贫铁粒贫 增高增高 减低减低 增高增高 增高增高一、血清和红细胞叶酸测定一、血清和红细胞叶酸测定叶酸测定（叶酸测定（measurement of folacin））RIARIA，，核素核素+ +叶酸叶酸→→放射碘叶酸化合物。

放射碘叶酸化合物血清叶酸：成年男性血清叶酸：成年男性8.618.61～～23.8nmol23.8nmol／／L L 叶酸减低：巨幼细胞贫血，红细胞过度增生叶酸减低：巨幼细胞贫血，红细胞过度增生 （如溶贫、骨髓增生性疾病等）如溶贫、骨髓增生性疾病等） 女性女性7.937.93～～20.4nmol20.4nmol／／L L红细胞与血清中的叶红细胞与血清中的叶酸浓度相差几十倍，当酸浓度相差几十倍，当未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏尤其有价值判断叶酸缺乏尤其有价值红细胞叶酸：成人红细胞叶酸：成人340340～～1020nmol1020nmol／／L L红细胞红细胞第二节第二节 叶酸和维生素叶酸和维生素B12 B12 的检验的检验二、血清维生素二、血清维生素B B1212测定测定RIARIA法，用抗氧化剂和氰化钾在碱性环法，用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下（境下（pHpH＞＞1212））, ,将人血清中的维生素将人血清中的维生素B B1212从载体蛋白中释放出从载体蛋白中释放出来。

加入来加入5757Co Co 标记的维生素标记的维生素B B1212, ,与固定在微晶纤维颗粒上纯与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素化的维生素B B1212结合物竞争结合，检测其放射活性，其量与受结合物竞争结合，检测其放射活性，其量与受检血清的维生素检血清的维生素B B1212含量成反比，与标准管作对照，换算出维含量成反比，与标准管作对照，换算出维生素生素B B1212含量成人成人148148～～660pmol660pmol／／L L降低：巨幼细胞贫血降低：巨幼细胞贫血增高：白血病患者增高：白血病患者\ \真性红细胞增多症真性红细胞增多症\ \恶性肿瘤和肝细胞损伤恶性肿瘤和肝细胞损伤四、血清内因子阻断抗体测定四、血清内因子阻断抗体测定用用5757CoCo标记的维生素标记的维生素B12B12与血清中的内因子结与血清中的内因子结合，形成合，形成5757CoCo标记的维生素标记的维生素B12B12－内因子复合－内因子复合物；当存在内因子抗体时物；当存在内因子抗体时, ,形成的复合物的形成的复合物的量减少检测其放射活性，与阳性对照管进量减少检测其放射活性，与阳性对照管进行比较，可得知内因子抗体的存在。

阴性：行比较，可得知内因子抗体的存在阴性：正常人，比值正常人，比值≤≤1.001.00±±0.100.10阳性：比值阳性：比值≥≥阳性对照血清比值阳性对照血清比值±±0.100.10内因内因子阻断抗体阳性：多见于由维生素子阻断抗体阳性：多见于由维生素B12 B12 缺缺乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等红细胞寿命测定（红细胞寿命测定（erythrocyte life span determination）是将放射性核素（）是将放射性核素（5151CrCr）标记）标记的红细胞注入血循环后，逐日观察其消失率，的红细胞注入血循环后，逐日观察其消失率，记录成活曲线，计算出红细胞寿命记录成活曲线，计算出红细胞寿命半寿期为半寿期为2525～～3232天天红细胞寿命缩短：红细胞寿命缩短：（（1 1）溶血性贫血，约为）溶血性贫血，约为1414天2 2）再生障碍性贫血，约为）再生障碍性贫血，约为1515～～2929天第三节第三节 溶血的检验溶血的检验四、血浆高铁血红素白蛋白检测四、血浆高铁血红素白蛋白检测高铁血红素白蛋白高铁血红素白蛋白+ +硫化铵硫化铵 铵血色原铵血色原用光谱仪在绿光区用光谱仪在绿光区558nm 558nm 处有一最佳吸收区带。

处有一最佳吸收区带正常人呈阴性正常人呈阴性血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白1 1、原理、原理 五、五、血清结合珠蛋白(Hp)测定1.待侧血清待侧血清+Hb液液→Hp-Hb复合物复合物+未结合未结合Hb2.电泳分离出电泳分离出Hp-Hb复合物电泳法电泳法 0.5－－1.6g/L1.减低：常见于各种溶血，尤其是血管内溶血减低：常见于各种溶血，尤其是血管内溶血排除严重肝病及传单排除严重肝病及传单2.增高：感染、增高：感染、SLE、创伤、恶肿、妊娠等创伤、恶肿、妊娠等六、尿卟啉检测六、尿卟啉检测尿中卟啉类物质在酸性条件尿中卟啉类物质在酸性条件下，经乙醚提取，于下，经乙醚提取，于405nm405nm处显红色荧光，处显红色荧光，从而可对尿卟啉进行定性检测正常人呈从而可对尿卟啉进行定性检测正常人呈阴性阴性①①增加：先天性红细胞生成性卟啉病、迟发增加：先天性红细胞生成性卟啉病、迟发性皮肤型卟啉病、肝红细胞生成型卟啉病性皮肤型卟啉病、肝红细胞生成型卟啉病等②②对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定和珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定价值。

价值 五、尿含铁血黄素试验五、尿含铁血黄素试验又称又称Rous试验当血红蛋白通过肾试验当血红蛋白通过肾滤过时，滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出尿中含铁血黄素是不细胞，并随尿液排出尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀尿沉渣肾小管细胞内色的亚铁氰化铁沉淀尿沉渣肾小管细胞内外可见直径外可见直径1 1～～3 3μm的蓝色颗粒的蓝色颗粒正常人呈阴性正常人呈阴性①①阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出无论有无血红阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如PNHPNH，本试验结果即，本试验结果即呈阳性，并可持续数周呈阳性，并可持续数周②②溶血初期，虽然有血红蛋白尿，此时本试验可呈阴性反应溶血初期，虽然有血红蛋白尿，此时本试验可呈阴性反应 一、红细胞渗透脆性试验一、红细胞渗透脆性试验渗透脆性试验（渗透脆性试验（osmotic fragility test）检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。

红细胞在）检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力红细胞在低渗盐溶液中，当水渗透其内部达一定程度时，红细胞发生低渗盐溶液中，当水渗透其内部达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂膨胀破裂开始溶血：开始溶血：75.275.2～～82.1mmol82.1mmol／／L L（（4.44.4～～4.8g4.8g／／L L））NaCl NaCl 完全溶血：完全溶血：47.947.9～～54.7mmol54.7mmol／／L L（（2.82.8～～3.2g3.2g／／L L））NaClNaCl①①脆性增加：遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症脆性增加：遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血和部分自身免疫性溶血性贫血②②脆性降低：珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白脆性降低：珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白C C、、D D、、E E病，低病，低色素性贫血、肝疾病等色素性贫血、肝疾病等第四节第四节 红细胞膜缺陷的检验红细胞膜缺陷的检验二、自身溶血试验及其纠正试验二、自身溶血试验及其纠正试验红细胞在红细胞在37℃37℃孵育孵育4848小时，其间由小时，其间由于膜异常引起钠内流倾向明显增加，于膜异常引起钠内流倾向明显增加，ATPATP消耗过多；或糖酵解途消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引起径酶缺乏所引起ATPATP生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。

在孵育时，加入葡萄糖或试验在孵育时，加入葡萄糖或ATPATP作为纠正物，观察溶血可否作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验有一定的纠正，称为纠正试验正常人红细胞孵育正常人红细胞孵育4848小时小时, ,不加纠正物的溶血率＜不加纠正物的溶血率＜3.53.5％，加葡萄糖％，加葡萄糖的溶血率＜的溶血率＜1.01.0％，加％，加ATPATP纠正物的溶血率＜纠正物的溶血率＜0.80.8％①①遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，加入葡萄糖或遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，加入葡萄糖或ATPATP后后明显纠正明显纠正②②G G－－6 6－－PDPD缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病人自身溶缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖纠正血率增加，能被葡萄糖纠正③③丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生萄糖产生ATP ,ATP ,其自身溶血率明显增加，加葡萄糖不能纠正，加其自身溶血率明显增加，加葡萄糖不能纠正，加ATPATP可纠正④④获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果常各有不同，对诊断意义不大常各有不同，对诊断意义不大。

⑤⑤本试验不够敏感和特异，仅对本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形红细胞增多症有较大诊断价值遗传性球形红细胞增多症有较大诊断价值. . 三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定NaNa＋＋－－K K＋＋－－ATPATP酶、酶、CaCa2 2＋＋－－MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶和酶和MgMg2 2＋＋－－ATP ATP 酶都是红细胞膜上的酶都是红细胞膜上的ATPATP酶为测定酶的活酶为测定酶的活性可分别测定酶作用于性可分别测定酶作用于ATPATP的水解产物无机磷含量，若在基质中的水解产物无机磷含量，若在基质中只加入只加入CaCa2 2＋＋－－MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶可测定酶可测定CaCa2 2＋＋－－MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶的活性，若酶的活性，若在基质中加入在基质中加入NaNa＋＋、、K K＋＋、、MgMg2 2＋＋和和ATPATP，测定的为，测定的为NaNa＋＋－－K K＋＋－－ATPATP酶酶和和MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶的共同含量，再在基质中加入酶的共同含量，再在基质中加入NaNa＋＋－－K K＋＋－－ATPATP酶的酶的抑制剂，测定结果仅为抑制剂，测定结果仅为MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶活性，两者的差为酶活性，两者的差为NaNa＋＋－－K K＋＋－－ATPATP酶活性。

酶活性红细胞膜红细胞膜NaNa＋＋－－K K＋＋－－ATPATP酶：（酶：（2.932.93±±0.670.67））mUmU／／10109 9红细胞红细胞CaCa2 2＋＋－－MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶：酶：0.40.4～～2.5μmol2.5μmol／／L L－－1 1.mg .mg 膜蛋白膜蛋白.h.h－－1 1遗传性球形红细胞增多症：遗传性球形红细胞增多症：NaNa＋＋－－K K＋＋－－ATPATP酶活性增加，酶活性增加，CaCa2 2＋＋－－MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶活性减低酶活性减低蚕豆病：蚕豆病：CaCa2 2＋＋－－MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶活性降低酶活性降低许多药物作用于红细胞时，许多药物作用于红细胞时，NaNa＋＋－－K K＋＋－－ATPATP酶和酶和CaCa2 2＋＋－－MgMg2 2＋＋－－ATPATP酶酶活性改变活性改变四、酸化甘油溶血试验四、酸化甘油溶血试验当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时，可阻止其中的水快速进入红细胞内，使溶血过程缓慢液时，可阻止其中的水快速进入红细胞内，使溶血过程缓慢但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少。

当红细胞膜但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺时，它们在蛋白及膜脂质有缺时，它们在pH6.85pH6.85的甘油缓冲液中比正常的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至5050％的时％的时间（间（AGLT50AGLT50）明显缩短正常人）明显缩短正常人AGLT50AGLT50＞＞290s290s遗传性球形红细胞增多症遗传性球形红细胞增多症AGLT50AGLT50明显缩短（明显缩短（2525～～150s150s）自身免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等AGLT50AGLT50也可缩短也可缩短五、高渗冷溶血试验五、高渗冷溶血试验在高渗状态下，温度骤然变化影响红细在高渗状态下，温度骤然变化影响红细胞膜脂质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合胞膜脂质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点，红细胞容易破裂而发生溶血当膜蛋白缺陷致膜表位点，红细胞容易破裂而发生溶血当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率明显增加而膜表面积与体面积与体积比值降低，溶血率明显增加。

而膜表面积与体积比值增加，溶血率降低高渗冷溶血试验积比值增加，溶血率降低高渗冷溶血试验（（hyperosmotic cold hemolysis testhyperosmotic cold hemolysis test）即测定红细胞在）即测定红细胞在不同浓度的高渗缓冲液中，从不同浓度的高渗缓冲液中，从37℃37℃水浴立即置于水浴立即置于0℃0℃水浴一水浴一定时间的最大溶血率定时间的最大溶血率9mmol9mmol／／L L或或12mmol12mmol／／L L蔗糖蔗糖 最大溶血率最大溶血率66.566.5％～％～74.174.1％％7mmol7mmol／／L L蔗糖蔗糖 大溶血率大溶血率0.10.1％～％～16.916.9％％①①遗传性球形红细胞增多症明显增加遗传性球形红细胞增多症明显增加②②珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病明显降低珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病明显降低③③自身免疫性溶血性贫血基本正常自身免疫性溶血性贫血基本正常2 2、参考值：、参考值： 六、红细胞膜蛋白电泳分析六、红细胞膜蛋白电泳分析将制备的红细胞膜样品进行将制备的红细胞膜样品进行SDSSDS－－PAGE(SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶) )电泳，根据样品中各蛋白相对分子质电泳，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。

白组分百分率各种膜蛋白组分百分率变化较大，多以正常红细胞膜蛋白电泳图各种膜蛋白组分百分率变化较大，多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较；或以带谱作比较；或以带3 3蛋白为基准，各膜蛋白含量以与带蛋白为基准，各膜蛋白含量以与带3 3蛋白的比蛋白的比例表示许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常各种膜缺陷疾病如遗传许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常各种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常某些血性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常红蛋白病骨架蛋白等可明显异常一、高铁血红蛋白还原试验一、高铁血红蛋白还原试验在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白，正常红细胞的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白，正常红细胞的G G－－6 6－－PDPD催化催化戊糖旁路使戊糖旁路使NADPNADP变成变成NADPHNADPH，其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作，其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（用而使高铁血红蛋白（FeFe3 3＋＋）还原成亚铁血红蛋白（）还原成亚铁血红蛋白（FeFe2 2＋＋），），通过比色可观察还原的多少。

当通过比色可观察还原的多少当G G－－6 6－－PDPD缺乏时，高铁血红蛋缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降白还原率下降正常人高铁血红蛋白还原率正常人高铁血红蛋白还原率≥≥7575％％（脐带血（脐带血≥≥77 77 ％）％）G G－－6 6－－PDPD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降中间缺乏（杂合子）为中间缺乏（杂合子）为3131％～％～7474％，严重缺％，严重缺乏（半合子或纯合子）＜乏（半合子或纯合子）＜3030％第五节第五节 红细胞酶缺陷的检验红细胞酶缺陷的检验二、变性珠蛋白小体生成试验二、变性珠蛋白小体生成试验G G－－6 6－－PDPD缺乏的病人血样加缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于入乙酰苯肼于37 ℃37 ℃孵孵2 2～～4 4小时，用煌焦油蓝染色观察红小时，用煌焦油蓝染色观察红细胞中珠蛋白小体的生成情况，计算含细胞中珠蛋白小体的生成情况，计算含5 5个及以上珠蛋白个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率正常人含小体的红细胞的百分率正常人含5 5个及以上珠蛋白小体个及以上珠蛋白小体的红细胞，一般＜的红细胞，一般＜3030％G G－－6 6－－PDPD缺乏症常高于缺乏症常高于4545％，故可作为％，故可作为G G－－6 6－－PDPD缺乏的筛缺乏的筛检试验。

但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红检试验但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为蛋白病含小体的细胞百分率为7575％～％～8484％，％，HbHHbH病和化学病和化学物质中毒时也增高物质中毒时也增高三、葡萄糖三、葡萄糖-6--6-磷酸脱氢酶荧光斑点试磷酸脱氢酶荧光斑点试 验和活性测定验和活性测定在在G-6-PDG-6-PD和和NADPNADP＋＋存在下，存在下，G-6-PDG-6-PD能使能使NADPNADP＋＋还原成还原成NADPHNADPH，，后者在紫外线照射下会发出荧光后者在紫外线照射下会发出荧光NADPHNADPH的吸收峰在波长的吸收峰在波长340nm340nm处，可通过单位时间生成的处，可通过单位时间生成的NADPHNADPH的量来测定的量来测定G-6-PDG-6-PD活性正常人有很强的荧光正常人有很强的荧光 G-6-PDG-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光；杂缺陷者荧光很弱或无荧光；杂合子或某些合子或某些G-6-PDG-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光正常人变异者则可能有轻到中度荧光正常人酶活性为（酶活性为（12.112.1±±2.092.09））U/gHbU/gHb。

四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定在二磷酸腺苷在二磷酸腺苷（（ADPADP）存在的条件下丙酮酸激酶（）存在的条件下丙酮酸激酶（pyruvate kinase pyruvate kinase ，，PKPK）催化磷酸烯醇丙酮酸（）催化磷酸烯醇丙酮酸（PEPPEP）转化成丙酮酸，在辅酶）转化成丙酮酸，在辅酶ⅠⅠ还原型（还原型（NADHNADH）存在的情况下丙酮酸被）存在的情况下丙酮酸被LDH LDH 转化为乳酸，转化为乳酸，若标记荧光于若标记荧光于NADHNADH上，此时有荧光的上，此时有荧光的NADHNADH变为无荧光的变为无荧光的NADNAD正常人丙酮酸激酶活性斑点在正常人丙酮酸激酶活性斑点在2525分钟内消失分钟内消失酶活性（酶活性（15.015.0±±1.991.99））U U／／gHb gHb 荧光斑点不消失或时间延荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光光2525～～6060分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光6060分钟分钟不消失。

不消失 五、谷胱甘肽还原酶缺陷检测五、谷胱甘肽还原酶缺陷检测谷胱甘肽还原酶（谷胱甘肽还原酶（GRGR）催化反）催化反应中应中NADPHNADPH转变为转变为NADPNADP＋＋，荧光消失，通过在，荧光消失，通过在365nm365nm处观察处观察荧光斑点消失的时间（荧光斑点消失的时间（GRGR荧光斑点试验）反映谷胱甘肽还荧光斑点试验）反映谷胱甘肽还原酶的活性，或直接测定吸光度的变化（原酶的活性，或直接测定吸光度的变化（GRGR活性定量试验）活性定量试验）计算计算GRGR的活性的活性GRGR荧光斑点试验：正常人荧光斑点荧光斑点试验：正常人荧光斑点15min15min内内消失消失GRGR活性定量：（活性定量：（7.177.17±±1.091.09））U U／／gHbgHb谷胱甘肽还原酶缺乏时，谷胱甘肽还原酶缺乏时，GRGR荧光斑点试验荧光斑点试验15 15 分钟以后还有荧光存在，分钟以后还有荧光存在，GRGR活性定量试验活活性定量试验活性低于性低于7.17U7.17U／／gHb gHb 一、红细胞包涵体试验一、红细胞包涵体试验红细胞包涵体试验（红细胞包涵体试验（Heinz－－body forming test）） 是将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定是将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。

血红蛋白易变性沉淀形成包涵体正常人＜（正常人＜（1 1％）％）①①不稳定血红蛋白病：孵育不稳定血红蛋白病：孵育1 1～～3 3小时多数红细胞内可出现变性珠小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体蛋白肽链沉淀形成的包涵体G G－－6 6－－PDPD缺乏或红细胞还原酶缺缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体②②HbHHbH病：孵育病：孵育1 1小时就可出现包涵体，也叫小时就可出现包涵体，也叫HbHHbH包涵体第六节第六节 血红蛋白异常的检验血红蛋白异常的检验1 1、原理：、原理： 二、血红蛋白电泳检测二、血红蛋白电泳检测血红蛋白电泳（血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis）） 是根据不同的血红是根据不同的血红蛋白所带电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不蛋白所带电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，经一定电压和时间的电泳，可分离出各自的区带，同时对同，经一定电压和时间的电泳，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。

析2 2、参考值：、参考值：（（1 1））pH8.6TEBpH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳正常血红蛋白电泳区带：缓冲液醋酸纤维膜电泳正常血红蛋白电泳区带：HbAHbA＞＞9595％、％、HbFHbF＜＜2 2％、％、HbAHbA2 2为为1.01.0％～％～3.13.1％①①通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带如蛋白区带如HbHHbH、、HbEHbE、、HbBatrsHbBatrs、、HbSHbS、、HbDHbD和和HbCHbC等异常血红等异常血红蛋白异常蛋白异常②②HbAHbA2 2增多，见于增多，见于ββ珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标验室诊断指标HbEHbE病时也在病时也在HbAHbA2 2区带位置处增加，但含量很区带位置处增加，但含量很大（在大（在1010％以上）％以上）HbAHbA2 2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病三、抗碱血红蛋白检测三、抗碱血红蛋白检测将待检的溶血液与一定量的将待检的溶血液与一定量的NaOHNaOH溶液混合，溶液混合，作用作用1 1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。

胎儿血红蛋白分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应胎儿血红蛋白（（HbFHbF）抗碱变性作用强，没有变性存在于上清液中，）抗碱变性作用强，没有变性存在于上清液中，HbAHbA变性变性沉淀，取上清液于沉淀，取上清液于540nm540nm处测定吸光度，检测出处测定吸光度，检测出HbFHbF的浓度此的浓度此试验也称为碱变性试验，成人＜试验也称为碱变性试验，成人＜2 2％；新生儿＜％；新生儿＜4040％％①HbF①HbF绝对增多：珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达绝对增多：珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达3030％～％～9090％，％，中间型常为中间型常为5 5％～％～3030％，轻型小于％，轻型小于5 5％遗传性胎儿血红蛋白持％遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，可高达续综合征患者，可高达100100％②②HbFHbF相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、及再生障碍性贫血、PNHPNH、卟啉病等卟啉病等③③HbFHbF生理性增多见于孕妇和新生儿生理性增多见于孕妇和新生儿 四、四、HbFHbF酸洗脱法检测酸洗脱法检测HbFHbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比HbAHbA强。

将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含强将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含HbFHbF的红细胞不被的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbAHbA的红细胞均被酸洗脱，的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色正常血片中含不能被伊红着色正常血片中含HbFHbF的着色红细胞：成人＜的着色红细胞：成人＜0.010.01（（1 1％）新生儿％）新生儿0.550.55～～0.850.85（（5555％～％～8585％）以后渐渐下降，％）以后渐渐下降，2 2岁后幼儿＜岁后幼儿＜0.020.02（（2 2％）孕妇可有轻度增加着色细胞增加：％）孕妇可有轻度增加着色细胞增加：珠蛋白合成障碍性贫血重型患者大多数红细胞染成红色；轻珠蛋白合成障碍性贫血重型患者大多数红细胞染成红色；轻型患者可见少数染成红色的细胞；遗传性胎儿血红蛋白持续型患者可见少数染成红色的细胞；遗传性胎儿血红蛋白持续综合征红细胞均为红色综合征红细胞均为红色五、异丙醇沉淀试验五、异丙醇沉淀试验不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解，在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶剂，在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白更快地沉淀。

通过观察血红蛋白液在异中，不稳定血红蛋白更快地沉淀通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检正常人血红丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检正常人血红蛋白液为阴性（蛋白液为阴性（3030分钟内不沉淀）分钟内不沉淀）不稳定血红蛋白存在时，常于不稳定血红蛋白存在时，常于5 5分钟时出现沉淀，分钟时出现沉淀，2020分钟开始出分钟开始出现绒毛状沉淀血液中含有较多现绒毛状沉淀血液中含有较多HbFHbF、、HbHHbH、、HbEHbE时也可出现阳时也可出现阳性结果六、热变性试验六、热变性试验热变性试验（热变性试验（heat instability test）是根据不稳）是根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在液在50℃50℃时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检正常人热沉淀的血红蛋白＜正常人热沉淀的血红蛋白＜1 1％％血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白存在血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白存在七、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测七、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白的空间红蛋白的空间结构，血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚结构，血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各肽链区带。

正常血红蛋白肽链区带正常血红蛋白HbAHbA裂解后出现裂解后出现ββ、、HbAHbA、、HbA2HbA2和和αα四条带本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，表示有异常血红蛋白存在对珠蛋白生成障表示有异常血红蛋白存在对珠蛋白生成障碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值2 2、参考值：、参考值： 正常人：阴性正常人：阴性一、酸化血清溶血试验一、酸化血清溶血试验酸化血清溶血试验，也称酸化血清溶血试验，也称Ham’s test ，，即红细即红细胞在酸性（胞在酸性（pH6.4pH6.4～～6.56.5）的正常血清中孵育，）的正常血清中孵育，补体被激活，补体被激活，PNHPNH红细胞破坏而产生溶血而红细胞破坏而产生溶血而正常红细胞不被溶解，无溶血现象本试验阳性主要见于正常红细胞不被溶解，无溶血现象本试验阳性主要见于PNHPNH，某些自身免疫性血性贫血发作严重时可呈阳性某些自身免疫性血性贫血发作严重时可呈阳性第七节第七节 PNHPNH的检验的检验1 1、原理：、原理： 二、蔗糖溶血试验二、蔗糖溶血试验蔗糖溶血试验（蔗糖溶血试验（sucrose hemolysis test）是根据）是根据PNHPNH患者的红患者的红细胞细胞, ,在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育，补体与红细胞膜结合加强，蔗糖溶液进入红细胞内，育，补体与红细胞膜结合加强，蔗糖溶液进入红细胞内，导致渗透性溶血而设计的。

导致渗透性溶血而设计的定性试验：正常为阴性定性试验：正常为阴性定量试验：正常溶血率＜定量试验：正常溶血率＜5 5％％阳性或溶血率增加：阳性或溶血率增加：PNHPNH患者（可作为患者（可作为PNHPNH的筛选试验）；自的筛选试验）；自身免疫性溶血性贫血身免疫性溶血性贫血假阳性：白血病、骨髓硬化假阳性：白血病、骨髓硬化三、蛇素毒因子溶血试验三、蛇素毒因子溶血试验蛇毒因子溶血试验（蛇毒因子溶血试验（venom hemolysis test）采）采用从眼镜蛇毒中提取的一种蛇毒因子（用从眼镜蛇毒中提取的一种蛇毒因子（C3bC3b），），通过旁路途径激活补体，通过旁路途径激活补体，PNHPNH患者的红细胞补体患者的红细胞补体系统激活后，促使系统激活后，促使PNHPNH补体敏感细胞破坏、溶血正常人溶血率补体敏感细胞破坏、溶血正常人溶血率＜＜5 5％％溶血率增加，溶血率增加，PNHPNH的可能性大，可反映的可能性大，可反映PNH ⅢPNH Ⅲ型红细胞的溶血情况正常红细胞、型红细胞的溶血情况正常红细胞、PNH IPNH I型型和和PNH ⅡPNH Ⅱ型等的红细胞均不发生溶血型等的红细胞均不发生溶血第八节第八节 免疫性溶血性贫血的检验免疫性溶血性贫血的检验1 1、原理：、原理：抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验抗抗人人球球蛋蛋白白试试验验直接直接Coombs试验：试验：间接间接Coombs试验试验:应用抗人球蛋白试剂（抗应用抗人球蛋白试剂（抗IgG/或抗或抗C3d）与红细胞表）与红细胞表面的面的IgG分子结合，如红细分子结合，如红细胞表面存在自身抗体，出胞表面存在自身抗体，出现凝集反应现凝集反应。

应用应用Rh(D)阳性阳性O型正常型正常人红细胞与受检血清混合人红细胞与受检血清混合孵育，如血清中存在不完孵育，如血清中存在不完全抗体，红细胞致敏，再全抗体，红细胞致敏，再加入抗人球蛋白血清，可加入抗人球蛋白血清，可出现凝集出现凝集+ ++ ++ +CoombsCoombs试验检测原理图试验检测原理图完全抗体完全抗体凝集凝集凝集凝集致敏红细胞无凝集致敏红细胞无凝集不完全抗体不完全抗体2 2、参考值：、参考值：正常人正常人DAGT/IAGTDAGT/IAGT试验均为阴性试验均为阴性3 3、临床评价：、临床评价：自身免疫性溶血性贫血自身免疫性溶血性贫血冷凝集素综合症冷凝集素综合症新生儿同种免疫性溶血新生儿同种免疫性溶血阵发性冷性血红蛋白尿阵发性冷性血红蛋白尿药物性免疫性溶血等药物性免疫性溶血等阳性：阳性：冷凝集素试验冷凝集素试验冷凝集素综合征的患者血清中存在冷凝集素，为冷凝集素综合征的患者血清中存在冷凝集素，为IgMIgM类完全类完全抗体在低温时可使自身红细胞、抗体在低温时可使自身红细胞、O O型红细胞型红细胞 或与受检者血或与受检者血型相同的红细胞发生凝集型相同的红细胞发生凝集凝集反应的高峰在凝集反应的高峰在0 0～～4℃4℃，当温度回升到，当温度回升到37℃37℃时凝集消失。

时凝集消失正常人血清抗红细胞抗原的正常人血清抗红细胞抗原的IgMIgM冷凝集素效价＜冷凝集素效价＜1:321:32冷凝集素综合征的患者为阳性，效价可达冷凝集素综合征的患者为阳性，效价可达1:10001:1000以上淋巴瘤、支原体肺炎、疟疾、流行性感冒等可引起冷凝集素巴瘤、支原体肺炎、疟疾、流行性感冒等可引起冷凝集素效价继发性增高效价继发性增高。