仪器分析 高效液相色谱法 1.ppt

高效液相色谱法 high performance liquid chromatography 1p以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论 与实验方法，发展而成的分离分析方法p以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实 现检测和仪器化具有分离效能高、分析速 度快、应用范围广等的优点第一节第一节 概述概述 2与与气相色谱法对比气相色谱法对比pGC 快速、分离效率高、样品用量少在约 300万个有机化合物中，可以直接用该法分析的 占20%pHPLC 快速、分离效率高、样品不受挥发性及 热稳定性的约束，因而分析对象广3与经典液相色谱法的比较LCHPLC固定相粒度 (m)70~590%3~10柱长长（cm）10~10010~30 柱内径（cm）2~50.1~0.5 柱效（n）10~100103~105 样样品用量（g ）1~1010-7~10-2分析时间时间 （h ）1~200.05~1装置非仪仪器化仪仪器化4第一节第一节 高效液相色谱法的主要类型和原高效液相色谱法的主要类型和原 理理pLLC和LSCp分配、吸附、离子交换和空间排阻p化学健合相色谱法 ISC和PIC/IPC5二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法p将固定液的官能团键合在载体的表面构成化学键 合相。

p以化学键合相为固定相的色谱法称为键合相色谱 法p键合相色谱法是应用最广的色谱法6键合相色谱法键合相色谱法p正相色谱法p反相色谱法§RHPLC §ISC§PIC or IPC7（（一）正相键合相色谱法一）正相键合相色谱法p 固定相：氰基、氨基化学键合相氨基键 合相 色谱柱是分析糖类最重要的色谱柱p 流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂p 分离机制：范德华作用力（定向力、诱导力或 氢键）流动相的极性与容量因子的关系：流动相的极性与容量因子的关系：流动相极性流动相极性 ，洗脱能力，洗脱能力 ，，k k ，，t tR R 8（二）反相键合相色谱法（二）反相键合相色谱法p常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS ） p常用流动相：甲醇—水，乙腈—水p分析对象：非极性、中等极性的分子型化合 物p分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的 保留是溶质分子与极性分子间的排斥力 9反相键合相色谱法反相键合相色谱法影响保留行为的因素影响保留行为的因素pp溶质的分子结构溶质的分子结构 极性，疏水性，k，tR pp流动相流动相 与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，kpp固定相固定相随碳链延长，键合相疏水性， k碳链一定时，键合相浓度， k10离子抑制色谱法离子抑制色谱法 ISCISCpISC—调节RLLC流动相pH值以抑制组分的离解 p抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲 液 p分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以 中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配 平衡。

p分析对象：3.0≤pKa ≤ 7.0的弱酸7.0 ≤ pKa ≤ 7.0的弱碱两性化合物 11ISC p容量因子及其影响因素对于弱酸：流动相pH 流动相极性p固定相：极性键合相 p流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂 p正相洗脱时，依靠组分的极性差别而分离p出峰顺序：极性小的组分先出峰31（三）反相键合相色谱法的分离条（三）反相键合相色谱法的分离条 件件p流动相极性>固定相极性p固定相：非极性键合相 p流动相：甲醇-水、乙腈-水，常加入弱酸、弱碱或 缓冲盐调节流动相pH以抑制组分离解，增加保留反相洗脱时，出峰顺序：极性大的组分先出峰 32（四）反相离子对色谱法的分离条（四）反相离子对色谱法的分离条 件件p离子对试剂的选择p流动相pH的选择p有机溶剂及其浓度的选择33四、其他固定相四、其他固定相p键合型离子交换剂p手性固定相 分析、分离对映体的最重要 手段制备单一构型的活性异构体是世界制 药业的大方向p亲和色谱固定相 虽然并非新方法，但近年 来有了长足的发展利用亲合反应的专属性 ，该法已成为生化药物纯化、分析的重要手 段34亲和色谱固定相举例亲和色谱固定相举例2O CHSiNH3()2O2)(CHOCNH NNOHOHCH2POOOCOOO氨丙基硅胶 间隔臂 CMP固定相可用于细胞色素C、核糖核酸酶、溶 菌酶等多种蛋白质的纯度分析。