imagej荧光定量方法.doc

1、 安装后首先打开 ImageJ ：2、 打开要分析图片： File>open （热键为 Ctrl+O ）3、 转换成 8bit 的灰度图： Image>Type>8 -bit4、 黑白反转（因为对于光密度（ OD ）来说越白数值越小，纯白为 0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）： Edit>Invert （热键为 Ctrl+Shift+I ）5、 校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略） ： Analyze>Calibrate在弹出来的界面的 Function 选择 Uncalibrated OD ，并下界面左下方勾选 Global calibration ，然后点击右下角的 OK点击 OK 后会跳出校正后的光密度曲线：如不勾选 Global calibration ，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选 Disable GlobalCalibration ，勾选 Disable these Messages6、 选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位） ：Analyze>Set scale点击后在弹出的界面里点击中间的 click to Remove Scale ，并勾选下面的 Global （同样的，如不选Global 这个测量单位的选择只对这张图片有效） ，最后点击 OK7、 选择测量项目： Analyze>Set Measurements在弹出界面中选择我们需要测量的项目 Area 、Integrated density 个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），并勾选下面的 Limit to threshold，选择后点击 OK（这8、选择测量域值： Image>Adjust>Threshold （热键为 Ctrl+Shift+T ）滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的 Set在弹出来的界面点击 OK9、 测量： Analyze>Measure （热键为 Ctrl+M 或直接按 M）10 、 记录数据并计算：结果中的 Area 为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积； IntDen选范围的 IOD （光密度的总和） 。

结果界面中的数据可以复制到 Excel 等软件中进行计算用 IntDen 的数值除以 Area 的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为就是所例，即： 18854/179252=0.105181532 （/pixel ）同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较以下附上分别应用 Image -Pro Plus 及 ImageJ 对五张图片进行分析的结果对比：从结果的对比看来 ImageJ 与 IPP （ Image -Pro Plus ）的分析结果是基本一致的。