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第十二章第十二章 DNADNA的复制、修复及重组的复制、修复及重组DNADNA技术技术1分子生物学的中心法则分子生物学的中心法则(central dogma)(central dogma) DNA RNA DNA RNA 蛋白质蛋白质 复制复制转录转录翻译翻译逆转录逆转录RNARNA复制复制2第一节 DNA复制的几个基本原则（特点） 一 、半保留复制（semiconservative replication） 模板模板 原则原则 特点特点 亲代的亲代的DNADNA双链，每股链都可作为模板双链，每股链都可作为模板 按按碱基配对碱基配对原则指导新链的合成原则指导新链的合成 合成的两个子代合成的两个子代DNADNA分子碱基顺序与亲分子碱基顺序与亲代分子完全一样代分子完全一样 一条链来自于亲代的一条链来自于亲代的DNADNA链，另一条链链，另一条链是新合成的链是新合成的链35二、半不连续复制二、半不连续复制（semidiscontinuous replicationsemidiscontinuous replication）1 1、 体内仅存在体内仅存在5 35 3的的DNADNA聚合酶聚合酶2 2、 前导链前导链与与随从链（岗崎片段）随从链（岗崎片段）655533335555333355553333 前导链前导链随从链随从链岗崎片段岗崎片段半不连续复制半不连续复制7前导链（前导链（leading strandleading strand）：）： DNADNA复制复制时，一股以时，一股以3 53 5方向方向的母链作为的母链作为模板模板，指导新合成的链以，指导新合成的链以5 5 33方向方向连续连续合成的链称为前导链。

合成的链称为前导链复制方向与解链方向一致）（复制方向与解链方向一致）8随从链（随从链（lagging strand):lagging strand): DNADNA复制复制时，一股以时，一股以5 35 3方向的方向的母链作为母链作为模板模板，指导新合成的链沿，指导新合成的链沿5 5 33合成，合成，1000200010002000个核苷酸个核苷酸不连续的小不连续的小片段片段的链称为随从链的链称为随从链复制方向与解链方向相反（复制方向与解链方向相反) )9岗崎片段（岗崎片段（OkazakiOkazaki）：）： DNADNA复制复制时，一股以时，一股以5 35 3方向的母方向的母链作为模板，指导新合成的链沿链作为模板，指导新合成的链沿5 35 3合成合成1000200010002000个核苷酸个核苷酸不连续的小片段不连续的小片段称称之为岗崎片段之为岗崎片段岗崎片段由岗崎片段由DNADNA连接酶连成一条完整的新链连接酶连成一条完整的新链10 半不连续复制：半不连续复制： 在在DNADNA复制复制过程中，过程中， 亲代亲代DNADNA分子中以分子中以3 53 5方向的母链方向的母链作为作为模板模板指导新的链以指导新的链以5 35 3 方向方向连续连续合成，合成， 另一股以另一股以5 35 3 为方向的母链则指为方向的母链则指导新合成的链以导新合成的链以 5 35 3方向合成方向合成1000100020002000个核个核 苷酸长度的许多苷酸长度的许多不连续不连续的片段（的片段（岗崎片段），岗崎片段）， 这种复制方式称之为半不连续复制。

这种复制方式称之为半不连续复制11三、RNA引物DNADNA聚合酶聚合酶 不能不能催化两个游离的催化两个游离的dNTPdNTP在在DNADNA模板上聚合模板上聚合 需要具需要具3-OH3-OH的引物的引物RNARNA聚合酶聚合酶 能能催化两个游离的催化两个游离的NTPNTP在在DNADNA模板上聚合模板上聚合 提供提供3-OH3-OH 引物最后要被引物最后要被DNADNA聚合聚合酶酶除去，缺口由该除去，缺口由该酶补满，再由连接酶酶补满，再由连接酶连接连接减少突变，提高减少突变，提高DNADNA复制的真实性复制的真实性125555333355553333 前导链前导链随从链随从链岗崎片段岗崎片段RNARNA引物引物3-OH3-OH13四、复制的真实性四、复制的真实性 DNADNA的半保留复制的半保留复制 遵守严格的碱基配对规律遵守严格的碱基配对规律 RNARNA引物引物 DNADNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 复制出错是有即时的校读功能复制出错是有即时的校读功能(3 5(3 5 外切酶功能）外切酶功能） DNADNA损伤的修复机制损伤的修复机制14第二节 参与DNA复制的一些酶类和蛋白质DNADNA链合成的条件链合成的条件 dNTPdNTP MgMg+ 3-OH3-OH引物引物 DNADNA模板模板 酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子15 酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子 DNADNA聚合酶聚合酶/ DNADNA解链酶解链酶 DNADNA结合蛋白结合蛋白(SSB(SSB） 拓扑异构酶拓扑异构酶/ 引发体引发体 DNADNA连接酶连接酶16一、大肠埃希菌一、大肠埃希菌DNADNA聚合酶（原核生物）聚合酶（原核生物） 3,5-磷酸二酯键35图12-417DNADNA聚合酶聚合酶 多功能酶多功能酶 5 35 3外切酶外切酶 3 53 5外切酶外切酶 5 3 5 3聚合酶聚合酶 单链多肽单链多肽 大小二个片段大小二个片段 切除切除RNARNA引物，引物， 填补空缺填补空缺 损伤后修复损伤后修复DNADNA聚合酶聚合酶与与 多功能酶多功能酶 5 35 3聚合酶聚合酶 3 53 5外切酶外切酶 不对称二聚体不对称二聚体单体单体1 1- -前导链前导链/ /单体单体2 2- -随从链随从链 DNA DNA 复制的主要酶复制的主要酶 高续进性高续进性 高聚合酶活性高聚合酶活性 高产物真实性高产物真实性18 3 5 5 33 5 5 3 外切酶外切酶 聚合酶聚合酶N NC C 5 3 5 3外切酶外切酶小片段小片段大片段（大片段（ klenow klenow片段）片段）切除切除RNARNA引物引物损伤修复损伤修复校读功能校读功能（常用的工具酶）常用的工具酶）DNADNA聚合酶聚合酶（DNA PolymeraseDNA Polymerase） Kornberg Kornberg酶酶 DNA DNA指导的指导的DNADNA聚合酶聚合酶 （DNA-Directed DNA Polymerase, DDDPDNA-Directed DNA Polymerase, DDDP）聚合功能聚合功能19DNA聚合酶全酶（DNA Polymerase holoenzyme） 1010种不同亚基组成种不同亚基组成 2 2 DNADNA聚合酶聚合酶 (4(4个个) ) DNADNA聚合酶聚合酶全酶全酶 核心聚合酶核心聚合酶 二聚体形式连接两个二聚体形式连接两个核心聚合酶核心聚合酶 单个运载夹钳单个运载夹钳 星环状星环状, ,容纳容纳DNADNA双链双链2021二、真核细胞的DNA聚合酶 五种五种 DNA DNA 聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶和和PCNAPCNA DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶、 参与随从链的合成参与随从链的合成 参与前导链的合成参与前导链的合成 参与线粒体参与线粒体DNADNA的合成的合成 参与参与DNADNA的修复的修复22三、解链、解旋酶类 DNADNA解链酶解链酶（helicasehelicase） DNADNA结合蛋白结合蛋白(SSB(SSB） 解开解开DNADNA双链双链每个每个bpbp消耗消耗2 2个个ATPATP 与单链与单链DNADNA结合结合, ,维持单链维持单链状态状态 (“ (“镇纸镇纸”)”) 使其不受核酸酶水解使其不受核酸酶水解 避免单链避免单链DNADNA自身发夹螺旋自身发夹螺旋形成形成 使前端螺旋易解开使前端螺旋易解开23 拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerastopoisomeras） 转转轴酶轴酶 拓扑异构酶拓扑异构酶 旋转酶旋转酶 （gyrasegyrase） 切断切断DNADNA双螺旋中的双螺旋中的一股一股，张力下降后封闭。

张力下降后封闭 切断切断DNADNA双链双链，使另一双，使另一双链经过此缺口，再封闭链经过此缺口，再封闭24四、引发体（primosome） 蛋白质蛋白质 DnaADnaA DnaBDnaB 引物酶引物酶 结合到结合到DNADNA双链复制起始部位双链复制起始部位( (需需ATP)ATP) 解链酶的作用解链酶的作用 合成合成RNARNA引物引物RNARNA引物的合成和复制的起始必需的引物的合成和复制的起始必需的2526五、DNA连接酶 催化二段催化二段DNADNA链之间链之间3,5 3,5 磷酸二酯键的形磷酸二酯键的形成成33OHOH5533 O OOO- - P O P O O O- -有缺口的有缺口的DNADNA链链DNADNA连接酶连接酶ATPATPAMP+PPiAMP+PPi O OOO P O P O O O- -533缺口封闭缺口封闭27 缺口填补缺口填补: : 连接双股连接双股DNADNA分子中一链的缺口分子中一链的缺口 双链双链DNADNA分子中双链的缺口分子中双链的缺口 不能不能连接二分子单链连接二分子单链DNADNA 28应用应用: :1.1.岗崎片段之间的连接岗崎片段之间的连接. .2.DNA2.DNA损伤修复中的连接损伤修复中的连接. .3.3.一种重要的工具酶一种重要的工具酶: : 限制性内切酶切割后形成的粘性末端或限制性内切酶切割后形成的粘性末端或平头末端的连接平头末端的连接. .29第三节 DNA复制过程(起始、延长、终止） 确定复制的起始点确定复制的起始点 解开双链解开双链DNA,DNA,提供单链提供单链DNADNA模板模板 形成复制叉形成复制叉 DNADNA合成的起始和延长合成的起始和延长 形成带有新合成的形成带有新合成的DNADNA片段的复制泡片段的复制泡 复制的终止复制的终止30 原核生物原核生物 双向复制双向复制（型复制）型复制） 特定起始点：特定起始点：oriCoriC 真核生物真核生物 多个复制单位多个复制单位（复制泡（复制泡）（复制起始点（复制起始点+ +复制叉）复制叉） 多个起始点多个起始点一一. .复制的起始复制的起始31大肠埃希菌复制起始点大肠埃希菌复制起始点oriCoriC的结构的结构32 原核生物双向复制（原核生物双向复制（型复制）型复制）33真核生物复制泡（复制起始点真核生物复制泡（复制起始点+ +复制叉）复制叉）34DNADNA双链复制起始点双链复制起始点 DnaADnaADnaB/DnaCDnaB/DnaCDNADNA双链解开成双链解开成单链单链DNADNASSBSSB引物酶引物酶RNARNA引物引物/3-OH/3-OHDNADNA聚合酶聚合酶dNTPdNTP和和3-OH3-OH形成形成3535磷酸二酯键磷酸二酯键解旋酶解链酶SSBSSB33335555引发体解链、解链、解旋酶解旋酶拓扑异构酶拓扑异构酶35二二. .复制的延长复制的延长1.1.在在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，的作用下，2.2.前导链前导链合成合成1000-20001000-2000个核苷酸后，个核苷酸后，3.3.随从链随从链开始合成，岗崎片段的长度开始合成，岗崎片段的长度 为为1000-20001000-2000个（大肠杆菌）个（大肠杆菌） 4. Pol4. Pol为不对称二聚体，为不对称二聚体， 一个作用于前导链，一个作用于前导链， 另一个作用于随从链另一个作用于随从链(loop)(loop)。

3637553335图12-1338图12-1439三、复制的终止 去除去除RNARNA引物引物 补充空缺补充空缺 连接连接 DNADNA聚合酶聚合酶的小片段的小片段 5 35 3外切酶外切酶 DNADNA聚合酶聚合酶的大片段的大片段 3 53 5外切酶外切酶 5 3 5 3聚合酶聚合酶 DNADNA连接酶连接酶40335555334。