PCR各步骤的目的.docx

PCR 各步骤的目的（一）预变性：破坏 DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构 使 DNA 充分变性，减少 DNA 复杂结构对扩增 的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的 DNA 模板，最好不要吝啬这个步 骤此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行二）变性 --退火 --延伸循环：① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩 增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；② 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 55C左右，引物 与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸： DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶 序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链三）用PCR仪扩增时,（变性•退火，延伸）循环完成后，继续72度延伸了 10分钟的原因：1. 延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用 t aqDNA 聚合酶， 72 度时的碱基掺入率为 35-100bp/s ，因此延伸速率为 1 kb/min 。

2. 根据延伸速率推得，扩增 1kb 以内的 dna 片段 1min 即可，而 3-4kb 则需要 3-4min ，依次照 推通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至 4-1 0min ，这样做是使 pcr 反应完全以提高扩增产量3. 继续 72度延伸了 10分钟除了可以使 pcr 反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在 用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。